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果蝇唾腺染色体的制备

   日期:2014-07-21     浏览:372    评论:0    
核心提示:本世纪初,D.Kostoff用压片法首先在果蝇(Drosophila melanogaster)幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体——唾液腺染色体(salivary gland chromosomes)。由于它具有许多重要特点而成为细胞遗传学、发生遗传学、进化遗传学和分子遗传学研究中不可多得的好材料。
本世纪初,D.Kostoff用压片法首先在果蝇(Drosophila melanogaster)幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体——唾液腺染色体(salivary gland chromosomes)。由于它具有许多重要特点而成为细胞遗传学、发生遗传学、进化遗传学和分子遗传学研究中不可多得的好材料。

【实验目的】
1.掌握取材及制作巨染色体标本的基本方法。
2.了解体细胞染色体联会现象,观察果蝇唾腺染色体的形态特征,并根据唾腺染色体上横纹的形态和排列,识别不同的染色体。
3.识别染色体结构变异的细胞学表现。

【实验原理】
双翅目昆虫的整个消化道细胞(从唾液腺一直到直肠)发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂而停止在分裂间期。此时唾液腺细胞的数量不再增加,仅体积增大,其核内染色体连续不断地复制,但着丝点不分裂,形成由上千条螺旋状的染色线构成一条多线染色体。多线染色体螺旋化程度低、异常松弛,并且同源染色体常处于紧密配对状态——“体细胞联会”。因此多线染色体比细胞分裂中期的染色体长100~200倍,宽1000~2000倍,显微镜下计数比一般体细胞染色体数少一半。由于多线染色体不同区段染色线的螺旋化程度不同,染色后形成了深浅不一、明暗相间、宽窄各异的横纹。各对染色体上横纹的多少、形态、大小、分布及染色的深浅各不一样,具有种族特异性。唾腺染色体上还有因螺旋线解旋、疏松膨大而形成的疏松区(puff)和裴氏环(Balbiani ring)。疏松区可能是合成RNA的场所,与基因的表达有关。
果蝇种间或种内不同品系与近缘种之间的遗传差异常表现为唾液腺染色体不联会,形成泡(puff)、缢痕(constrictions)、间带区(interband)的伸缩性以及顶体(telomere)的形态等多方面的变异,特别重要的是可观察是否产生了倒位、染色体的断裂、融合或重排,据此研究其基因序列的差异。因此,无论从细胞遗传学的角度研究基因与突变性状之间的关系,还是从进化遗传学方面研究染色体的系统发育,探讨近缘种间的遗传差异和生殖隔离机制等,唾液腺染色体的分析研究都是十分重要的。果蝇唾液腺染色体已广泛用于种内系统发育和种间亲缘关系的研究中。
普通果蝇(2n=2x=8)唾腺染色体的特点表现在:各染色体着丝点附近异染色质区相互结合形成染色很深的染色中心,第Ⅱ、Ⅲ对染色体呈V形(中着丝粒),各有两臂,X染色体呈棒状,第Ⅳ对染色体呈粒状,观察时可见五条臂由染色中心向外蜿蜒伸展。

【实验器材和试剂】
1. 器材 显微镜、生化培养箱、果蝇培养瓶、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、吸水纸等。
2. 试剂 0.7%氯化钠(NaCl¬)水溶液、1mol/L HCl、改良苯酚品红染色液、果蝇培养基等。
3. 材料 果蝇三龄幼虫活体。

【实验方法】
1.培养果蝇三龄幼虫 将果蝇放在营养丰富的培养基中,15℃~18℃下饲养,幼虫要生长肥大,才能获得较大的唾腺。具体要为①饲料松软,含水量较高,营养丰富,发酵良好(建议配方:玉米粉10g,红糖13g,琼脂1g,酵母粉2g,丙酸3~4滴,加蒸馏水100~120ml)。②追加酵母液。在一龄幼虫出现后,将成虫移入另一培养瓶中,在饲料表面滴加低浓度的酵母液(2%~4.5%),每天滴加1~2滴;2龄~3龄幼虫时期适当增加酵母液的浓度(约10%左右);滴加的量以覆盖在饲料表面薄薄的一层为宜。③控制幼虫的密度。一般情况下,半磅牛奶瓶中10对成虫交配后在12h左右必须将成虫转移,一般要求每cm2培养基表面20~40只幼虫左右。④低温培养:稍低的温度有利于幼虫的充分生长发育,一般15℃~18℃较为合适。
2.取唾腺法 挑选生长肥大的三龄幼虫放入表面皿中用0.7%的生理盐水尽量洗去幼虫体表所沾附的培养基,然后将幼虫置载玻片上,滴1~2滴0.7%生理盐水,找到具有口器的头部(有一小黑点),一手用解剖针刺入(或压住)头部,将虫固定,一手用摄子夹紧幼虫下半部(尾端1/3处),轻轻向两端拉开,唾腺随头部拉出。在低倍显微镜下,调节好光亮度观察,可见一对半透明、隐约可见细胞界限的囊状物——唾腺。移去虫体其余部份,用解剖针剔除附在唾腺一侧深色泡沫状的脂肪体,以保证制片质量。若载片上杂质较多,可用生理盐水适当冲洗,用吸水纸吸去多余的生理盐水。
注意:在整个剥离过程中,不能让载片上的生理盐水干涸,否则唾腺收缩而不易剥离;冲洗残渣和吸去多余水液时,要避免唾腺被吸水纸吸走。
3.解离 将剥好的唾腺移到载片中央,加一滴1 mol/L HCl于腺体上,解离2~3min,使组织疏松,以便压片时细胞分散,染色体展开。
4.染色 用吸水纸吸去HCl,加1滴蒸馏水轻轻冲洗后,小心吸干。加1~2滴改良苯酚品红或其它染液,染色10~15min。
5.压片 同细胞有丝分裂染色体压片的操作。
注意:压片时适当多加些染液有利于染色体臂的伸展,但要防止染液过多而造成材料随染液而溢出。
6.镜检 在低倍镜选择唾腺细胞多且染色体分散好的视野,换高倍镜仔细观察唾腺染色体的染色中心、染色体臂和横纹以及可能有的疏松区、裴氏环、或因易位而形成的十字形图象和因倒位而形成的倒位环等各种结构。

【注意事项】
1. 在整个剥离过程中,不能让载片上的生理盐水干涸,否则唾腺收缩而不易剥离;冲洗残渣和吸去多余水液时,要避免唾腺被吸水纸吸走。
2. 取唾腺时,尽量将脂肪去除。
3. 吸取余液时需小心,防止唾腺被吸水纸吸走。
4. HCL使组织疏散,利于细胞分散,染色体展开。
5. 染色时间不可过长,否则不利观察。
6. 压片时适当多加些染液有利于染色体臂的伸展,但要防止染液过多而造成材料随染液而溢出。
 
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