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人类染色体标本制备

   日期:2014-07-21     浏览:866    评论:0    
核心提示:类型及表面货号浓度尺寸(um)规格COMPtrol Kit, Goat anti-Mouse Ig (HL) Coated Particles, 2 populations (NegativeHigh)CMIgP-30-2K1.0107/mL3.
人体内任何旺盛有丝分裂的细胞或者在体外适当培养下能旺盛分裂的组织细胞群,均可作为细胞遗传学研究的材料,用于制备染色体标本。常用的材料有外周血淋巴细胞、骨髓细胞、羊水细胞、绒毛细胞、胸腹水细胞、性腺活检组织、精子、实体瘤组织,以及皮肤、肝和肾等组织。这些材料按下述方法进行处理后,都可作为研究人类染色体的材料,用于染色体病的诊断和产前诊断等。
 
【实验目的】
    了解和掌握外周血细胞培养试剂的配制和消毒方法;学习、掌握培养细胞的染色体制备的一般方法,掌握人类染色体的一般形态结构。
 
【实验器材和试剂】
1.仪器设备 超净工作台、带有照相装置的光学显微镜、隔水式恒温培养箱或CO2培养箱、恒温水浴箱、电热干燥箱、离心机、冰箱、分析天平 (1/10 000)或电子天平、普通天平、高压蒸气灭菌锅、小型真空泵、电吹风、pH计、定时钟、秒表。
2.器材 G6型玻璃漏斗(细菌滤器)、蒸馏水瓶、蒸馏水器、10ml刻度离心管、10ml培养瓶(或青霉素小瓶、带瓶塞)、2ml注射器、吸管、滴管、烧杯、量筒、锥形瓶、试管架、三角烧瓶、染色缸、酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷盘、铝制饭盒、酒精棉球、碘酒棉球以及包布等。
3.试剂 RPMI-1640培养液(含10%~20%小牛血清)、NaHCO3、PHA、青霉素、链霉素、肝素溶液、秋水仙素或秋水仙胺、1mol/L HCl、双蒸水(ddH2O)、0.075mol/L KCl、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液液、pH6.8的PBS。
 
【实验内容与方法】
外周血的淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,它们都处于间期的G0或G1期,故在未经培养的外周血中很难见到正在分裂的淋巴细胞。1960年Nowell发现从芸豆(phaseolus vulgaris)中提取的能使红细胞凝集的物质——植物血球凝集素(phytohemgglutinin,PHA)可以刺激淋巴细胞,使其转化为幼稚的原始细胞样(blast like)的细胞淋巴母细胞而具有重新分裂的能力。以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本由于具有取材方便、用血量少(0.3~1.0ml)及容易培养、培养时间短即可得到大量有丝分裂相等优点,故该方法在国内外的有关实验室中以及临床上被广泛应用,细胞遗传学领域中几乎90%以上的研究取材于外周血。按容器是否密闭,培养方法可分两种:一种是使用二氧化碳培养箱,培养容器不需密闭,用循环的5%的CO2调节培养基的pH;另一种是使用普通的恒温箱,培养瓶口要密封或用瓶塞塞紧。后一种在一般实验室内即可做到。此外,按培养的血量或淋巴细胞数目,可分标准法、半微量或微量全血法(whole blood microculture)两种。
微量全血方法采血量少,尤其在对小儿、新生儿的研究中更为适用。在需要大量染色体标本(如进行G、Q显带的研究)以及需要积累大量有丝分裂细胞,尤其是早期分裂细胞(如高分辨染色体的研究)时,标准培养法仍然适用。
淋巴细胞在体外培养至72小时左右时,大多数细胞已处于第二次增殖周期内,在收获细胞前加入一定量的秋水仙素或秋水仙胺将细胞阻止于有丝分裂中期,可导致积累大量含有可见的中期染色体的细胞,然后将细胞悬液离心、低渗和固定处理,最后将细胞悬液滴于湿冷清洁的玻片上。空气中自然干燥即得可供分析的中期染色体标本。从染色体标本中不仅能精确计数染色体的数目,而且能用来检验个别染色体畸变(变异)。近年来,由于各种显带技术与高分辨染色体技术的问世与不断改进,使淋巴细胞培养已成为遗传学研究中的一种常用方法。?
 
一 人外周血淋巴细胞培养
以半微量全血法为例,有关器械的清洗和消毒、细胞培养用液的配制及消毒见附录。
1.采血 用一次性2ml注射器抽取肝素稀释液0.2ml,湿润针管,然后将多余的肝素排除。以碘酒及酒精清洗并消毒供血者肘部皮肤,用橡皮管结扎静脉回流的上端,将肝素预先润湿的注射器刺入肘部静脉,抽取静脉血0.5~2ml,然后转动针管,使血液和肝素混合。
2.接种和培养 在无菌室内的超净工作台上,或用酒精消毒培养瓶的翻口瓶塞后插入针头,将抽得的抗凝血迅速接种到5ml含适量PHA(约0.2ml)及小牛血清的培养瓶中,每瓶接种全血0.4ml左右(6号针头15~20滴),轻轻摇匀,置37℃培养箱中培养,根据研究需要与具体情况(如各实验室条件、试剂的影响等)可培养48~72小时,一般有丝分裂的高峰多在培养60~72小时之间。
标准培养法由于用血量大,不易为受检者接受。一般的程序是:取静脉血5~10ml,室温下静置1~2小时,或低速离心(400~500r/min)数分钟。此时可见血浆及介于血浆与红细胞层之间的白细胞层,将血浆及白细胞层吸出混匀,以0.6~0.8ml接种到已配制的混合培养液5ml中,剩余的红细胞层仍可按上述全血法进行培养。
3.积累中期细胞 在终止培养前4~6小时,用1ml注射器(装5号针头)加入浓度为5μg/ml的秋水仙素2滴,使培养液中的秋水仙素终浓度为0.05μg/ml。轻轻摇匀,放回培养箱中继续培养至72小时。加入秋水仙素的目的在于抑制纺锤丝的形成,使细胞分裂停止在中期。以下步骤则不需无菌操作。
 
二 染色体标本的制备
1.收获细胞 取出培养瓶,将培养液摇匀后倾入10ml刻度离心管中,在粗天平上配平后放入离心机,以1 000r/min离心8~10min,吸弃上清液,保留细胞悬液约0.5ml。
2.低渗处理 往离心管中加入8ml已温浴达37℃的0.075 mol/L KCl溶液,用吸管混匀,置37℃恒温水浴箱中低渗15~25min(精确的低渗时间可自行摸索)。
3.预固定 低渗处理完成后,加入1ml新配制的固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)并用吸管混匀,平衡后放入离心机,以1 000r/min离心8~10min。吸弃上清液。
4.固定 加入6ml固定液,用吸管将沉淀的细胞轻轻混合成细胞悬液,室温下静置20min后,1 000r/min离心8~10min。吸弃上清液。
5.再固定 加入4ml固定液,用吸管轻轻吹打使细胞混匀,室温下静止15min或更长时间。(如由于某种原因,不能立即制片时,可将离心管口盖好,置冰箱中过夜或更长时间)。
6.制片 将上述细胞混悬液离心(1 000r/min,8min),吸弃上清液,视离心管中沉淀(细胞)的多少加入0.2~0.4ml左右的固定液,用吸管轻轻混成细胞悬液(混合后的液体呈淡乳白色即表示细胞浓度适当)。用吸管吸取细胞悬液以20~35cm高的距离滴于清洁预冷的玻片上,每片滴2~3滴,滴完后立即对准玻片吹气以助细胞的分散,并立即将玻片放在酒精灯火焰上来回过几下(勿烤干),静置并空气中晾干。最好先滴片一张,置高倍镜下观察,如染色体分散良好,即可制片,如分散不好,可按上述方法再次固定。必要时可采用甲醇∶冰醋酸(1∶1)固定液进行固定,将会获得满意的染色体标本。
7.染色 若所制备的标本用于染色体的非显带分析,则将晾干的玻片标本用Giemsa染液(以1份Giemsa原液加9份pH 6.8的PBS液混合而成)染色5~10min。然后在自来水管下用细水流自玻片一端轻轻冲洗,晾干或吹干后镜检。
8.观察 将制片置于低倍镜下观察,选择染色体分散好,无胞浆背景的中期分裂相(图1-1),然后换高倍镜、油镜观察染色体形态,在镜下初步计数。

 
图1-1 显微镜下的人类非显带中期染色体
 
三 外周血淋巴细胞短期培养及制备染色体标本注意事项
外周血淋巴细胞短期培养及制备染色体标本并不困难,但如操作不严或试剂质量不好则可能使培养结果及标本制作不佳或失败。
1.防止污染是培养成功与否的先决条件,收获前的所有操作过程应保持高度无菌,严防细菌和病毒污染。
2.培养箱的温度应严格控制在37±0.5℃,为能精确有效地控温,在普通的隔水式恒温培养箱上可加装一个电子控温仪。
3.培养基的pH值应调整到7.2~7.4之间,偏酸时细胞发育不良,偏碱时细胞会出现轻度固缩。
4.在采血或接种时,注意不要使用太多的肝素,因肝素过多会抑制淋巴细胞的转化,但也不宜太少,否则易出现凝血现象。如果培养物中出现膜状凝块,可轻摇培养瓶使凝块散开。
5.注意培养过程中盖紧培养瓶口(开放式培养除外),以免培养液的pH值发生较大变化。如果培养液变黄,说明偏酸,此时可加入无菌的2%NaHCO3溶液或另加入2~3ml培养液进行调整。
6.PHA的质量好坏直接关系到人体淋巴细胞培养的成败,市售的PHA由于厂家、出厂时间、批号不同而有差异,精确的用量应自行摸索。一般使用量为每毫升培养液200~300μg(市售10mg安瓿瓶PHA用2ml生理盐水稀释,每瓶培养物加0.2~0.3ml)。PHA的量也不宜过大,否则会导致红细胞凝集。
7.所用的玻璃器皿及其它用品都要清洗干净,各种试剂尽量选用分析纯级。
8. 配制培养液等溶液所用双蒸水宜用玻璃蒸馏器制备。
9.离心机最好用水平式的,速度宜用1 000r/min,如速度太高,沉降在管底的细胞团不易打散;速度太低,分裂相易丢失。如果低渗后离心速度过高,则会使分裂细胞过早破裂,在最后制成的标本中,完整的分裂相过少。
10.秋水仙素的使用浓度和处理时间直接影响分裂相的数量及染色体的长度,量大使染色体缩短变粗,量少则分裂相少;时间长则染色体收缩。
11.低渗时间的长短关系到染色体分散的好坏,时间不足染色体分散不好,低渗过度则染色体分散过度甚至丢失。
12.固定应彻底,固定液要新鲜配制,吹打时用力要匀,不要过猛,以避免细胞破碎和染色体丢失。细胞悬液浓度要适宜,太高,染色体分散不好,太稀则不易找到好分裂相。
13.培养液在抽滤除菌时不要等全部培养液抽干,最后一点要弃之,这样可防止空气中的细菌进入已除菌的培养液中。
14.制片中如发现染色体分散不佳,可重复固定或延长固定时间。
15.滴片时如玻片冷却不够或有油污会影响细胞和染色体的分散。另外,要使染色体分散良好,还要注意细胞悬液的浓度和滴片的技巧等。
16.培养液中小牛血清的质量和比例也是影响细胞培养成败的重要因素。
17.培养失败的常见原因有:①培养瓶等器材未清洗干净;②培养用水不合格;③pH值过高或过低;④细菌污染;⑤PHA质量有问题;⑥供血者细胞免疫水平低下;⑦血清质量不佳等。
 
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