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流式细胞术中为什么要用同型对照?如何选择同型对照?

   日期:2014-07-14     浏览:133    评论:0    
核心提示:一、为什么要用同型对照?同 型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性
一、为什么要用同型对照?
同 型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型 对照是真正意思上的阴性对照,它不但可以用来设定流式细胞仪的电压,而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。
在流式细胞仪上样前,染色方式如下:样本管:一抗+样本,同型对照管:同型对照+样本

二、如何选择同型对照?
(1)一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体,比如抗人的CD56 FITC标记的抗体,成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型对照应该是FITC标记的MouseIgG1,κ。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.
(2)如果是抗体的组合形式是纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应该选择一抗的同型对照。比如CD86的纯化抗体,成分是MouseIgG1,κ。它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,。那么染色方式如下:样本管:纯化的CD86+PE标记的抗Mouse IgG1(二抗)+样本,同型对照管:纯化的同型对照+PE标记的抗MouseIgG1(二抗 )+样本.
(3)如果没有找到适合的同型对照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,那么优先选择的顺序应该是亚链不同--亚型不同--相同类别。比如,某种的抗体的来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照,那么优先选择相同荧光标记Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а,那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b,那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。
3、哪些客户需要使用同型对照?
A 对流式不是非常熟悉的客户。
B 做胞内流式客户,比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。
C 使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户,因为客户不熟悉不常见标志的表达情况,根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体,如多抗,非特异性结合非常多,使用同型对照可排除假阳性。
D 对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户,一般可以不使用同型对照。
4、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高?
首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次,因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么加入同型对照时,同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。
 
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