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凝胶柱层析关键的一环——如何选择凝胶填料

   日期:2014-07-14     浏览:277    评论:0    
核心提示:如何选择凝胶做分离纯化工作的人都知道,选择合适的填料是至关重要的。1.测定------分子量、PI当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时,可用
如何选择凝胶
做分离纯化工作的人都知道,选择合适的填料是至关重要的。
1.测定分子量、PI

当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时,可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中,可简易地测出PI,并选择纯化用缓冲液的最佳PH。

2.选择层析方法

若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解,可尝试几种不同的纯化方法:
一] 使用最通用的凝胶过滤方法,选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。
二] 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质,再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。
三] 体积大的样品,往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品,可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理,洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。

3.纯化大量粗品

处理大量原液时,为避免堵塞柱子,一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质,直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率,缩短纯化周期。

4.纯化硫酸氨样品

硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品,经处理过的样本处于高盐状态下,很适合直接上疏水层析。若作离子交换,需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术,随着介质种类不断增多,渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。

5.纯水糖类分子

固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素,可结合碳水化合物的糖类残基,很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器,纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质,专为俘获整个细胞或大复合物,如膜囊等。

6.纯化膜蛋白

膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者,避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质,籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。

7.纯化单抗、抗原

*单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用,能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理,在培养前除去IgG。重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性,基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200,很容易去除。
*疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。
*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG,再进一步获取IgG抗原。
*HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM,结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY,结合量达100mg纯IgY。
 

8.纯化重组蛋白

重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物,扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。
一] GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达,然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化,再利用凝血酶或因子Xa切开。
2. 蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达,以IgG Sepharose 6 FF纯化。
二] 含组氨酸标记(Histidine-tagged)的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金属,在一般或变性条件(8M尿素)下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。

9.纯化包涵体蛋白

包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高,复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品,并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白,复性回收率明显提高。

10.包涵体蛋白固相复性

*近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定(吸附)在层析介质上,一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后,蛋白在介质上成功复性,再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成,所以复性得率更高,而且无需大量稀释样品,并将复性和初纯化合二为一,大大节省时间及提高回收率。
*固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白;以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用,比一般试剂盒更方便、耐用。
 

11.纯化中草药有效成分

中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用,有效成份多较为亲水,包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析,更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能,例:如用甲醇分离黄酮甙,三糖甙先被洗下来,二糖甙其次,单糖甙随后,最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂,广泛用于各种天然产物的分离,包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。
*生物碱在酸性缓冲液中带正电,成为盐,HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反,黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中,在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。
*一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex,Sephacryl。若分子量在600KD以下,并需更高分辨率,可选择新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外,多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质,传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂,SOURCE反相层析可用范围为PH1-14 ,并可用1M NaOH,1M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗,寿命也更长。
 

12.纯化肽类

肽类的来源有天然萃取,合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解,但可从有机溶剂或促溶剂中复性,所以多以高选择性的反相层析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱,能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。

13.纯化核酸、病毒

核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子,和质粒DNA一样,可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白,再配合离子交换如Mono Q、 SOURCE Q分离核酸。

14.纯化寡核苷酸

寡酸苷酸多应用在反义(anti-sense)DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可除副产物,并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析,可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。

15.脱盐、小分子去除

使用凝胶过滤介质Sephadex G10,G15,G25,G50等去除小分子,效率高,处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液,就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子,简单直接。由于只是去除小分子,柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计,预装柱HiTrap Desalting(5ml)可用针筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。

16.疫苗纯化

使用凝胶过滤介质Sepharose 4FF纯化疫苗,去除培养基中的杂蛋白,处理量可大于床体积10%。柱高一般40-70cm,整个过程约半至一小时。目前使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR,如甲肝疫苗等。

17.抗生素聚合物分析

中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比,规定使用Sephadex G10凝胶过滤法测定。

18.纯化-基因治疗用病毒载体
SORRCE 15Q
 

19.纯化-基因治疗用质粒
Q Sepharose XL,SOURCE 15Q,STREAMLINE Q,Sephacryl S500,Plasmidselect

在下游纯化中,可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时,去除各种污染物。
1.去除内毒素
内毒素又称热原。含脂肪A、糖类和蛋白,是带负电的复合大分子。
内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集,无法上疏水层析。利用疏水层析试验盒(17-1349-01)可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。
内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶联内毒素底物如LAL,PMB,自动成亲合层析介质结合内毒素。内毒素经常是多聚体,凝胶过滤层析可有效地将之去除。


2.去除蛋白中的核酸
大量核酸增加样本黏度,令区带扩张,反压增加,降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。
胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷,在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP,SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL结合目标蛋白,可除去大量核酸。
核酸在高盐下会和蛋白解离,疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白,在纯化蛋白的同时去除核酸。
利用核酸酶将核酸切成小片断,用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。

3.去除病毒和微生物
病毒和微生物可成为病原,应尽量减除。结合不同层析技术,使用注射用水,用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗,皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D(solvent/detergent)处理,使病毒失活,如Triton和Tween。再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF结合目标蛋白,去除S/D。
其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活,凝胶过滤介质Superdex及多种吸附性介质,SOURCE都是很好的精细纯化介质,可去除多种微量污染物。
 
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