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流式细胞术的设门方法

   日期:2014-06-24     浏览:350    评论:0    
核心提示:流式细胞术数据分析目的就是需要确定所要研究的目的细胞器,这就涉及到设门。设门就是划定某一区域的细胞群体,对其单独加以分析或分选。门的形状可
流式细胞术数据分析目的就是需要确定所要研究的目的细胞器,这就涉及到设门。设门就是划定某一区域的细胞群体,对其单独加以分析或分选。门的形状可任意,方法有几种:(1)阈值设门。FSC(前向散射光)是最常用的阈值参数。FSC 和细胞的大小正相关。用FSC 设阈值,可以使低于该阈值的细胞碎片等其他杂质的信号不被处理。(2)散射光设门。以FSC 和SSC(侧向散射光)联合设门较常用。其最大优点是可以排除碎片或噪声的干扰。可以根据FSC vs SSC 散点图上不同细胞分布不同来设门目的细胞群。

另外还有荧光设门、反向设门和组合设门。流式细胞术的数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。应该注意到设门是一个主观行为,是人为做出的决定,不同的人设门会存在很大差异,它是流式细胞术中最难掌握的技术。因此,对设门有2 点需要把握:首先,设门尽可能客观;其次,应该认识到设门需要主观决策。为了尽量减少主观判断带来的误差,最好分选一些细胞用显微镜观察来进一步确认门的客观性和准确性。


流式细胞术的设门的注意事项:
通过流式细胞术分析细胞样品时,欲获得更加准确的分析结果,应用最优化的设门策略非常重要。要考虑的因素包括:
1)排除细胞碎片
2)应用合适的荧光阴性对照
3) 排除死细胞.
4) 如果合适,使用一种共享标记物(比如CD45白细胞标记或与之等效的泛-细胞群标记)染色
5) 设置必需的荧光分析点图

1)去除细胞碎片:在流式细胞仪上获取数据时,建立一个前向散射(FSC)VS. 侧向散射(SSC)点图,并通过调节各个光电倍增管装置以确定所有要分析的细胞群都在点图的可视范围内。在必要时,需要通过设置和调节FSC阈值,将大部分的细胞碎片、气泡和激光背景噪的干扰排除在分析区域之外(都应该设在FSC-low的区域)。接下来,在FSC vs SSC点图中圈出感兴趣的细胞群的周围区域(R1),这个区域可以被称为“R1-FSC vs SSC”。

(裂解后的人全血FSC vs SSC 的典型设置)

2) 应用合适的荧光阴性对照:染细胞时,建议您将细胞分在两个试管中,在其中一个试管中,用荧光标记的抗体染感兴趣的细胞,而另一个试管应用荧光同型抗体做为相应的阴性对照,这样有助于在分析中更精确地区分阳性信号和阴性的荧光背景。

3) 排除死细胞:通过Propidium Iodide (PI)或7-AAD等检测细胞活性的标记染细胞,以区分活细胞与死细胞。首先建立FSC vs“细胞活性染色”点图,然后将 “Region 1-FSC vs SSC”设置在这个点图上。 之后,圈出活细胞群区域,称为“Region 2-Viable”

4) 如果合适,使用一种共享标记物染色有时候,可以染一种在感兴趣的细胞与其他细胞都有表达的标记(例如在所有白细胞上都表达的CD45,)。虽然这个步骤不是必须的,但对于分析一些稀少细胞类型时有帮助。首先,建立一个FSC vs “共享标记物”的点图,将“Region 2-Viable”设置于这个点图上。然后,圈出所有表达这个标记的细胞群,设为“Region 3 - Shared Marker”。



5) 设置必需的荧光分析点图,
现在可以根据需要建立荧光分析点图(例如,FSC vs FITC 或FITC vs PE,等等)。确保将“Region 1 - FSC vs SSC”,“Region 2 – Viable”,和“Region 3 - Shared Marker”(如果适合的话) 等各个门都设置在每个荧光点图上。应用相应的荧光同型阴性对照有助于从背景荧光信号中区分出阳性信号。


 
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