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细胞可溶性蛋白质的流式微球技术定量检测

   日期:2014-05-14     浏览:322    评论:0    
核心提示:摘要:体细胞合成和分泌的可溶性蛋白质在机体生命活动过程中发挥重要作用, 实时、准确的定性、定量检测, 对评价机体的生理病理状态具有重要意义。常
摘要:

体细胞合成和分泌的可溶性蛋白质在机体生命活动过程中发挥重要作用, 实时、准确的定性、定量检测, 对评价机体的生理病理状态具有重要意义。常规EL ISA 方法存在标本用量大, 检测结果重复性差等缺点, 近年利用类似EL ISA 双抗体(包被抗体、检测抗体) 夹心法建立的流式细胞仪CBA ( cytometric beads array) 技术可以解决这些问题[ 1, 2 ] , 并在临床检验中得到广泛的推广应用。对于没有合适荧光标记单克隆抗体(检测抗体) 的可溶性蛋白, 如何实现流式细胞术( FCM) 定量检测尚有待探讨, 本文以胰岛素为例, 建立此类可溶性蛋白的CBA检测方法。

材料和方法

1.1主要试剂及仪器
纯化人胰岛素为Roche公司产品, 兔抗人胰岛素抗体( SC29168) 购自Santa Cruz公司, 异硫氰酸荧光素( F ITC) 标记的羊抗兔Ig购自DAKO公司, 直径3 μm聚苯乙烯微球(Cat No117134215)购自Polyscience公司, 其它生化试剂均为Sigma公司产品。FACSort流式细胞仪为美国BD公司产品。

2.1细胞培养和处理
鼠胰岛beta 细胞株N IT21 (购自美国ATCC)用含10%热灭活胎牛血清及青、链霉素(终浓度分别为100 U /ml , 100 mg/L) 的RPM I 1640培养。将对数生长期细胞(长至约80%满) 用0105%胰蛋白酶/0102% EDTA消化30 s22 min, 加入完全培养基终止消化, 收获细胞, PBS洗涤一遍, 加入200μl的1% SDS冰浴裂解细胞, 提取新鲜蛋白。取10μl新鲜提取物测定蛋白浓度, 其余280℃保存备用。

31胰岛素的FCM检测

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