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流式荧光染料分类

   2021-05-29 230
核心提示:一、荧光蛋白:(1)蛋白质结构编码了荧光。这些荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、YFP、RFP和各种衍生物。荧光蛋白始祖--绿色荧


一、荧光蛋白:

(1)蛋白质结构编码了荧光。这些荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、YFP、RFP和各种衍生物。
荧光蛋白始祖--绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),基于GFP晶体结构,通过定点或随机突变手段以期找到功能更强的GFP突变体。应用范围最广的当属增强型GFP(EGFP)和Emerald(祖母绿),不稳定增强型绿色荧光蛋白(dEGFP),增强型黄色荧光蛋白(EYFP),增强型蓝色荧光蛋白(EBFP),增强型蓝绿色(青色)荧光蛋白(ECFP)等各种衍生型GFP,发出的荧光颜色各不相同。

红色荧光蛋白


GFP 虽然用途广泛,但由于其发射光谱仅局限于440-529 nm, 细胞内成像时背景较高,无法对活体生物皮下进行更深的荧光标记。与GFP相比,其激发和发射波长更长,在细胞内成像时背景低,并且红色荧光蛋白能够与 GFP共同标记。

最早用于研究的红色荧光蛋白是 DsRed(发射峰在583nm),来源于珊瑚,荧光强、稳定性好。DsRed易形成寡聚体,且成熟速度慢,DsRed的突变体有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和mCherry,其中mStrawberry和mCherry,发射峰分别为596nm和610nm,亮度分别为EGFP的75%和50%左右。
常用荧光蛋白的物理属性
蛋白 光谱型颜色 激发峰(nm) 发射峰(nm) 亮度 光稳定性 pKa 聚集状态 发色团 虑光装置
EBFP2 蓝色 383 448 18 55 5.3 弱二聚体 SHG DAPI/BFP
ECFP 蓝绿色 433/445 475/503 13 64 4.7 弱二聚体 TWG CFP
mCerulean 蓝绿色 433/445 475/503 27/24 36 4.7 单体 TWG CFP
mTFP1 蓝绿-绿色 462 492 54 110 4.3 单体 AYG CFP
mEGFP 绿色 488 507 34 174 6 单体 TYG FITC/GFP
mEmerald 绿色 487 509 39 101 6 单体 TYG FITC/GFP
sfGFP 绿色 485 510 54 157 5.5 弱二聚体 TYG FITC/GFP
EYFP 黄色 514 527 51 60 6.9 弱二聚体 GYG FITF/YFP
mVenus 黄色 515 528 53 15 6 单体 GYG FITC/YFP
mCitrine 黄色 516 529 59 49 5.7 单体 GYG FITC/YFP
Ypet 黄色 517 530 80 49 5.6 弱二聚体 GYG FITC/YFP
mKO 橙色 548 559 31 122 5 单体 CYG TRITC/DsRed
tdTomato 橙色 554 581 95 98 4.7 T二聚体 MYG TRITC/DsRed
TagRFP 橙色 555 584 48 37 <4.0 单体 MYG TRITC/DsRed
mRFP1 红色 584 607 12.5 8.7 4.5 单体 QYG TxRed
mCherry 红色 587 610 17 96 <4.5 单体 MYG TxRed
mKate 远红外 588 635 15 166 6 单体 MYG TxRed
mPlum 远红外 590 649 3.2 53 <4.5 单体 MYG TxRed
(2)衍生自在藻类和植物中发现的藻胆蛋白。
这些蛋白质使用藻胆蛋白辅因子来吸收光能,包括藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)和紫草素叶绿素(PerCP)。
特点:
具有较大的斯托克斯位移(75-200 nm),并且具有稳定的发射光谱。
由于藻胆蛋白较大,因此它们在结合过程中通常具有1:1的蛋白质与荧光染料比率,因此对于定量流式细胞术非常有用。
易受光致漂白,不建议长时间或反复暴露于激发光源中。

二、有机小分子

FITC(分子量389 Da)、Alexa Fluor 488(FITC类似物,分子量643 Da)、Texas Red(TxRed,分子量625 Da)、Alexa Fluor 647(分子量1155 Da) 、Pacific Blue(分子量242 Da)和Cy5(分子量762 Da)等
特点:
具有一致的发射光谱和较小的斯托克斯位移(激发波长和发射波长之间的差,大约为50-100 nm)
光稳定好,容易与抗体偶联,应用广泛。

三、量子点

QDot是一种半导体,可以根据粒子的尺寸调整其不同的发射波长

五种不同的量子点探针溶液显示为用相同的长波长uv灯激发;探针的大小决定颜色。
blob.png
Qdot探针是纳米级(大约为蛋白质大小)的原子簇,包含数百至几千个原子的半导体材料(镉与硒或碲混合),该材料已被另外的半导体壳(硫化锌)覆盖 )以改善材料的光学性能。 这些粒子发荧光的方式与传统荧光团完全不同,而没有电子跃迁的参与。
特点:
亮度高、光稳定性好
QDots通常被紫激光激发,由于这些补偿问题难以解决,并且将Qdot结合到抗体上较为困难,所以这些试剂在多参数方案中大多被高分子染料取代。

四、聚合物染料

Brilliant Violet (BV)、Brilliant Ultraviolet (BUV) 和Brilliant Blue (BB)。
特点:
染料由收集光信号的聚合物链组成,可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基,“调节”吸收和发射特定波长的光。
这些染料非常稳定,与藻胆蛋白具有相似的量子效率,光稳定性大大提高。
仅吸收特定波长的光,因此避免了Qdots存在的跨波长激发的问题。

五、重金属离子

适用于质谱流式分析,不是用荧光素结合的,而是与镧系元素系列中的单个同位素重金属离子结合。
目前商业上有35种镧系元素同位素可用于抗体偶联。

六、串联染料

串联染料是利用Förster共振能量转移(称为FRET或荧光共振能量转移)原理的特殊类别的荧光分子。串联染料(或荧光团)由两个共价连接的荧光分子组成。一个用作供体分子,而另一个用作受体。这产生了具有供体分子的激发和受体的发射性质的独特荧光团。
特点:
串联染料非常亮,具有较大的斯托克斯位移值(150-300 nm),检测低密度的抗原时非常有用。
串联染料的稳定性不如供体荧光染料,并且能量转移效率因批次而异,使补偿复杂化。
注:串联染料非常敏感和容易降解。这导致受体发射光损失和供体发射光增强,特别是如果荧光团使用相同激光器激发。例如,如果使用PE和PE-Cy7,并且PE-Cy7荧光团开始降解,则其发射的光将在PE通道中检测到,从而给导致错误的数据。串联染料降解的主要原因之一(除了氧自由基)是暴露于光 - 这是完全可预防的!所以,当染色细胞时,避免曝光或处于极端的温度变化环境。后一种建议的原因是某些串联染料可能易受细胞介导的解耦影响,因此在低温下减慢细胞代谢可有助于保持稳定性。

七、核酸染料

核酸染料DAPI可嵌入到DNA双螺旋中

核酸荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度,就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量,并可以对细胞周期(如PI,7-AAD,DyeCycle Violet,DAPI)和细胞的增殖状况进行分析,分选染色体(如Hoescht 33342, Chromomycin A3),利用侧群分析对干细胞进行分选(如Hoescht 33342),死活细胞区分以及对细菌进行分选。。有多种荧光染料可以对细胞中的DNA或RNA染色,常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342等,RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

八、细胞增殖染料

用BrdU(溴脱氧尿嘧啶核苷)孵育细胞,使其掺入细胞DNA合成过程,然后用针对BrdU的抗体和DNA染料染色,便可测量细胞增殖。但是,此方法不适合长期增殖研究。
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。在合适的浓度下,不影响细胞生长或形态,适合长期增殖研究。

九、细胞死活染料

细胞活力可以通过排除性染料(如碘化丙啶、DAPI)确定,染料不能固定,仅适用于无感染性且需立即分析的细胞。也可通过染料与细胞内胺类物质的结合检测,胺类染料包括Live/Dead(ThermoFisher),Zombie(Biolegend)或Fixable Viablity(BD Biosciences),适用于固定的细胞,适合有传染性细胞、胞内抗原染色的细胞、多聚甲醛固定的细胞。

十、钙指示剂染料

钙指示剂染料与钙结合后会发生色移,可用于指示细胞激活和信号传导。
最常用的染料仍然是indo-1,即紫外双相钙探针。另外还有fluo-3的Blue-green calcium probes。
 
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