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MagCapture 外泌体分离试剂盒 常见问题

   日期:2019-06-25     浏览:123    评论:0    
核心提示:• 关于试剂盒的规范、性能Q1 本试剂盒使用了抗体吗?A1 没有使用抗体。使用了与金属离子结合和与磷脂酰丝氨酸(PS)结合的蛋

• 关于试剂盒的规范、性能

Q1 本试剂盒使用了抗体吗?

A1 没有使用抗体。使用了与金属离子结合和与磷脂酰丝氨酸(PS)结合的蛋白。


Q2 用此款试剂盒可提取什么样的细胞外囊泡呢?

A2 外泌体和大型细胞外囊泡(微小泡)。


Q3 外泌体和微泡的区别是?

A3 外泌体,是来源于晚期胞内体,直径为40-100nm的细胞外囊泡。微泡来源于细胞膜,直径100-1000nm的细胞外囊泡。


Q4 外泌体和微泡能可以分别纯化吗?

A4 可以。同时纯化的情况下,1200×g离心取上清液。纯化外泌体的情况下,10000×g离心取上清液。只纯化微泡的情况下,10000×g离心,沉淀置于TBS制成悬浊液备用。样品的前处理请参考操作说明书。


Q5 外壳型病毒也能回收吗?

A5 能。外壳性病毒膜表面也有PS,混入外壳性病毒的样品,所有PS都能回收。需要分离的情况下,使用本试剂盒回收后,需要用与病毒或者外泌体特异性抗原的抗体纯化。


Q6 所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸(PS)吗?

A6 尚未得到实验验证。通过分析外泌体的膜脂成分证实,有几种细胞(小鼠少突胶质细胞)来源于外泌体。因此,不会暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌体,而此款试剂不能纯化这种外泌体。


Q7 该试剂盒的样品是什么?

A7 使用细胞培养上层清液、血清或尿液效果显著。如果血浆中添加了螯合剂(比如EDTA)和柠檬酸,原理上无法分离外泌体。由于肝素处理过的血浆回收率低,从血液样本中回收请使用血清。


Q8 一次能回收多少外泌体?

A8 根据样品的种类和数量有很大的差异,据研究所实验记录,在一次的分离中最多能回收30μg蛋白质(通过BCA法检测)、1-2×1010粒子(通过纳米技术检测)。(K562培养基中的莫能菌素能促进外泌体分泌,可取5mL培养上清液进行回收)。

1 mL正常人混合血清能回收5×109颗粒(通过纳米技术检测)。


• 与传统法的比较


Q9 与超速离心法相比好处在哪?

A9 与超速离心法相比,本试剂盒能更简便、重复性好、高效地回收高纯度外泌体。也能回收超速离心法无法沉淀的外泌体。


Q10 与传统抗体亲和法相比,PS亲和的优势是什么?

A10 采用传统的抗体亲和法是用变性剂进行洗脱,此款试剂盒是在中性环境下用螯合剂来洗脱的,能完整回收外泌体,不会混入非特异性吸附物,能获得高纯度外泌体,提取纯度更高。传统的抗体亲和法只能特异性识别一种外泌体表面Marker蛋白质,而本试剂盒是特异性识别膜脂质成分,更能广泛获得外泌体。有事例表明识别表面Marker蛋白质抗体不能识别不同动物物种的抗原,而本试剂盒能在大范围的动物物种中运用(人,小鼠,牛等都有报道)。


Q11 与其他方法相比回收的纯度如何?

A11 与传统沉淀法(超速离心法、多聚物沉淀法)相比,纯度更高。与超速离心法和密度梯度离心法相结合的方法相比,能简便地获得同等高纯度的外泌体。


Q12 与其他方法相比回收率如何?

A12 与采用抗体的传统亲和法、超速离心法相比,能获得更高的回收率(低于聚合物沉淀法)。


• 关于试剂盒的操作方法、组成


Q13 操作该试剂盒耗时多久?

A13 (1个小时预处理样品),该试剂盒Exosome Capture 磁珠的固定需要15分钟,然后3个小时的化学反应,最后15分钟洗脱,总计3小时30分钟。


Q14 本试剂盒需要特别慎重的操作吗?

A14 Exosome Capture 固定化磁珠与样品反应后的清洗步骤中最后需要去除洗净液。完全去除后再进行提取。提取时在提取液中加入磁珠后,确保磁珠不发生凝集并处于悬浮状态。


Q15 提取液的组成有哪些?

A15 是含有1mM 的螯合剂、盐、防腐剂的Tris基础溶液。若以上成分阻碍后续分析,请使用超滤膜(Sartorius公司  VivaSpin500,使用100K分子量截留,Code:VS0141)并替换合适的Buffer。


Q16 Exosome Capture 固定后磁珠可以循环利用吗?

A16 可以。为了能够高效回收样品中的外泌体,试剂盒可完成5次回收实验。试剂盒里的缓冲液只含5次纯化的量。1mL体积以上样本建议进行浓缩后再回收,纯化时可进行反复抽提,提高纯化效率。详情参考操作说明书。


Q17 Exosome Capture 固定化磁珠能保存吗?

A17 可以。洗脱出外泌体后的磁珠需再使用,用试剂盒附带的 Washing buffer 或自制的TBS冷藏保存。


Q18 实验要留到第二天需要做什么步骤?

A18 Exosome Capture 固定化磁珠与样品的反应步骤(反应时间3小时)可以过夜。


• 关于样品用量


Q19 样品纯化所需的最低量是?

A19 使用旋转器的需要500μL以上,使用离心管混合器的需要100μL。样品量更少的情况下加TBS到所需最低量后再使用Exosome Capture 固定化磁珠。


Q20 大量的样品能回收吗?

A20 可浓缩后再回收。如果样品是培养上清,可以从体积50毫升的样品中回收外泌体。离心分离预处理后,取50mL上清液超滤浓缩至1mL(推荐Sartorius Viva Spin20 使用100K分子量截留、Code:VS2041)。无血清培养基和添加了10% FBS的培养基也可以收集外泌体。详情参照操作说明书。因为血清样品无法浓缩,最多只能用10mL的样品。但是大于1mL的血清回收率低,建议反复提纯。


• 关于外泌体提取后的分析


Q21 外泌体中含有什么?

A21 含有蛋白质、脂质、核酸(DNA、microRNA、mRNA)等。


Q22 提取后的细胞外囊泡可以用什么方法检测?

A22 因为能得到完整的细胞外囊泡,可以使用所有的分析方法。

(例)蛋白质分析:蛋白质电泳、免疫印迹、质谱分析、流式细胞术、ELISA等;

核酸分析如:定量PCR、微阵列(生物芯片)、新一代测序等;

粒子分析:电镜分析,纳米位点分析(NTA)等;

功能分析:体内外的用药实验等。


Q23 提取后的细胞外囊泡(EVs)能直接添加到细胞使用中吗?

A23 可以使用,但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影响,参考Q15替换合适的Buffer。使用离心过滤部件(Millipore 公司ΜLtrafree - MC, GV 0.22μm 已灭菌、Code:UFC30GV0S)除菌。


Q24 电镜分析需要外泌体的量是多少?

A24 能用电镜观察到2-4×1010的粒子(通过纳米技术检测)。


Q25 提取出的细胞外囊泡的保存条件是?

A25 冷藏、冷冻保存。长期保存需要放到-80℃。

为避免冻结溶解,冻结保存推荐细分后保存。


Q26 如何做回收的外泌体提取液的免疫印迹?

A26 本公司研究所从回收的100 μL提取液抽取15 μL,加入5 μL 4×SDS样品Buffer,共20μL的样品全量上样进行 SDS-PAGE。用量与宣传册上的免疫印迹的样本量一致。


• 关于外泌体标记


Q27 用该试剂盒提取出来的囊泡怎么判断是外泌体呢?

A27 根据表面抗原的抗体(WB)、电子显微镜、密度梯度离心、纳米粒度测量等来验证。


Q28 外泌体分离后用免疫印迹法确认的标记蛋白是什么?

A28 CD9, CD63, CD81, Frotillin-2, Lamp-1等。


• 相关产品

Q29 有在销售和光检测外泌体用的抗体吗?

A29 本公司当前销售以下抗体。

Ancell公司 白细胞分化抗原9 (人), 单克隆抗体 (SN4) (生物素标记) 产品编号:ANC-156-030

Ancell公司 白细胞分化抗原63 (人), 单克隆抗体 (AHN16.1) (R-藻红蛋白标记) 产品编号:ANC-215-050

Ancell公司 白细胞分化抗原81 (人), 单克隆抗体 (1.3.3.22) 产品编号:ANC-302-020

Q30 有可以从分离囊泡里提纯RNA的试剂盒吗?

A30 有。可使用microRNA Extractor SP Kit(295-71701)比AGPC法更能高效提纯RNA。

Q31 有销售磁支架吗?

A31 没有。使用 Thermo Scientific公司 DynaMag-2(12321D)等。

货号 名称 规格
293-77601 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
外泌体纯化试剂盒(PS亲和法)
10 tests



 
标签: 外泌体分离
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