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纳米抗体在小分子检测中的应用

   日期:2019-05-07     来源:阿帕克    浏览:36    评论:0    
核心提示:1. 纳米抗体在小分子检测中的优势小分子主要是指分子量小于1000Da的物质,本文主要讨论生理激素、农兽药残留、真菌毒素等。小分

1. 纳米抗体在小分子检测中的优势

小分子主要是指分子量小于1000Da的物质,本文主要讨论生理激素、农兽药残留、真菌毒素等。小分子因分子质量小、抗原表位单一,不能够同时结合两个抗体,目前免疫学分析方法多为竞争型。与传统的单克隆抗体,多克隆抗体相比,纳米抗体主要有一下优势:

1)纳米抗体更稳定 纳米抗体因其独特的结构赋予了自身的热稳定,因此可大大延长试剂的货架期。将 5 种OTA(赭曲霉毒素)抗体分别在25、 50、 65、 80、 95 ℃孵育 5 min,待温度降至室温后,测定 5 种抗体的抗原结合能力,结果如下图所示, McAb 6H8 在 80 ℃加热 5 min 完全失活,而四种纳米抗体在 95 ℃加热 5 min后,仍至少保留了约 50%的抗原结合能力,其中又以 Nb32 和 Nb36 的热稳定性最高。其次评估不同处理时间对抗体活性的影响,将 5 种抗体在 90 ℃分别孵育0、 5、 15、 30、 45、 60、 75 min,待温度降至室温后,测定 5 种抗体的抗原结合能力,结果如图所示, McAb 6H8 在 90 ℃加热 5 min 后完全失活,而四种纳米抗体在 90 ℃加热 60 min 后,仍至少保留了约 25%的抗原结合能力。

纳米抗体

2)能够容忍高有机溶剂 对于脂溶性的小分子来说,在提取过程中需要加入有机溶剂如甲醇,DMSO,乙酸等来提取,含有机溶剂的提取液,会在检测中引起基质干扰。虽然基质干扰可以通过稀释来消除,但是这会导致需要更高灵敏度的抗体。纳米抗体相对于传统单克隆抗体相比,具有很高耐有机溶剂的能力,如针对脂溶性的真菌毒素---黄曲霉毒素B1(AFB1)的纳米抗体Nb26与Nb28,在70%的甲醇条件下仍然具有抗体活性。

纳米抗体

Effects of MeOH on the performance of the nanobodies Nb26-based ELISA (A) and Nb28-based ELISA (B). PBS buffers containing methanol at different concentrations, 10%, 20%, 40%, 60%, and 70%, were used to make serial dilutions of free AFB1. The serial dilutions were mixed with equal volumes of nanobodies Nb26 and Nb28, and then 100 μL of the mixture was added into wells. The bound immunoreagents were detected by adding 100 μL of HRP conjugated anti HA-tag mAb for nanobody (1/10 000 dilution in PBS). Values are the mean ± standard deviation of three well replicates.

3)纳米抗体进行非常方便的基因操作,如双价,多价纳米抗体提高亲和力;加入各种标签以方便各种检测应用,如直接通过与AP酶融合表达,可缩短检测时间,降低了通过化学偶联AP酶而导致的披肩差异。

4)表达纯化方便,能够降低原料成本 纳米抗体可以非常方便在大肠杆菌中和酵母中进行发酵表达,因此制备成本低廉。

很多文献中提到因纳米抗体CDR3较长,一般用来识别构象表位,我们在文献中很少见到用纳米抗体来做WB实验。因此针对小分子纳米抗体开发难度比较大,那如何才能提高成功率与降低项目开发成本呢?

纳米抗体

2.抗原准备

小分子物质本身不具有免疫原性,因此建立小分子免疫学检测方法的关键是全抗原的合成,其结果直接影响能否获得纳米抗体。目前,小分子物质全抗原的合成主要通过人工化学合成的方法将活化的小分子与载体蛋白进行偶联,这个过程中需要考虑很多问题,就个人经验与大家交流,因本人知识有限,如果有错误,还请大家批评指正:

1.如果待测物本身含有NH2,COOH,OH等活性基团,可以利用待测物活性基团加入间隔臂,然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原,制备特异性良好的抗体。但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对小分子活性影响很大,就需要对小分子半抗原进行改造,来引入活性基团或从头合成。

2.如果待测物结构过于简单,可能也是不能建立免疫检测方法的。待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构,甚至含有杂原子,都能够增加制备出高质量抗体的可能性。简单的直链结构很难产生特异性很强的抗体,这也是一般选用直链作为间隔臂的原因。

3.小分子在与载体蛋白连接的部位很容易受到屏蔽,从而产生的抗体就会丧失对那些屏蔽基团的特异性。确定半抗原不受蛋白的屏蔽作用在人工抗原合成中非常重要,解决这一问题的最佳方法就是联入间隔臂。

4. 间隔臂的连接位点的选择,最好不要影响小分子化合物中特征性的基团暴露于免疫B细胞的抗原表位,这也是待测物本身的羧基,氨基一般不能直接联入间隔臂,因为这些基团对小分子药物的电性和极性影响非常大。而且引入的间隔臂不能影响主要基团的电子分布,例如苯环和其他杂环类的电子分布,这就要求间隔臂的极性和能量要低,将对小分子药物的电子排布和空间结构的影响降到最低,从这个角度来说,低能量的直链间隔臂是最佳的选择。联入间隔臂的半抗原的电子分布与目标待测物的电子特性一致性对抗体针对待测物的特异性至关重要。

5.半抗原间隔臂的连接位点,最好选择极性较低且远离半抗原的特征性结构。如果待测物的极性较高,半抗原合成的过程中最好保持其与目标待测物极性的一致性。人工抗原具有较高的极性,对于引发免疫反应有重要作用。

6.间隔臂引入不要太长,一般3~6个直连碳原子,太长会导致半抗原分子的折叠,使其更接近载体蛋白,屏蔽作用增强。

7.一般认为,用与免疫动物亲缘关系较远的蛋白作为载体可能会更好,KLH,BSA与HSA都是良好的载体蛋白,均能刺激动物产生特异性抗体。

在制备全抗原的过程中,需要同时准备两种不同载体蛋白的抗原,一种用于免疫,一种用于纳米抗体筛选及检测。

3.血清检测

经过三至四次免疫,采集羊驼颈静脉全血,检测血清,如果能与待测物形成竞争抑制,且IC50达到ng级,基本上算成功了大半。如果不能,项目就可以终止了。但在实验过程中,我们也发现虽然血清与待测物能够形成竞争抑制实验,但是我们并未筛选到合适的纳米抗体。我们将血清纯化分型发现,血清中只有IgG1能够待测物形成竞争抑制,而IgG2,IgG3均不能与待测物形成竞争抑制。因此我们所有针对小分子纳米抗体项目,在免疫后都采用检测IgG2与IgG3。


4.筛选方法

在构建完纳米抗体文库后,如何才能筛选到我们想要的高亲和力,高特异的纳米抗体呢?

1)抗原呈递

小分子筛选抗原的载体一般是BSA 或者OVA,呈递我们基本采用固相筛选呈递的方式,直接通过物理吸附固定于酶标板孔,非常方便。封闭液采用两种不同的无相关性的蛋白进行封闭如BSA,OVA,脱脂奶粉等。

2)选择压

筛选过程中选择压的控制非常重要,一般是通过控制包被抗原浓度,洗涤强度,竞争洗脱中控制小分子的浓度来筛选到高亲和力的纳米抗体。第一轮的筛选目的是为了从文库中尽可能多的捕获阳性克隆,同时去除无功能性展示的噬菌体残余。应该用多孔的包被后的靶标与大量的可溶性靶标,来确保大量的捕获结合后的噬菌体,以保持文库的多样性。在随后的几轮筛选中,选择压应该随着富集度的提高而提高,如提高洗涤次数,时间,降低包被浓度等。

3)洗脱

我们常见的有两种方法,一是酸洗脱,二是竞争洗脱。在小分子抗体筛选过程中,竞争洗脱基本上是使用最多的,效果也是最好的。目前有两种观点,一种是竞争洗脱液中待检小分子的浓度应该从高到底,另外一种恰恰相反,小分子的浓度应该从低到高。文献中报道的竞争洗脱基本都以第一种方法为主。

5.应用举例

随着科研学者对纳米抗体的深入认识,其在食品有害物质的检测分析、植物抗病虫害等食品安全领域的研究与应用得到广泛重视。 由于纳米抗体具有较强的抗原识别能力,可用于真菌毒素或农药残留等有毒小分子化合物的免疫学检测。美国 UC Davis分校的Bruce D hammock教授课题组在应用纳米抗体检测农药残留领域可算是首屈一指,国内小分子纳米抗体研究最早是南昌大学许杨教授课题组,主要研究针对真菌毒素的纳米抗体。下表总结了近些年纳米抗体在小分子检测领域的研究进展。

通过免疫羊驼使得特异性纳米抗体在动物体内经过亲和成熟并富集,因而较易从构建的纳米抗体文库中筛选得到亲和力好的纳米抗体,相比之下,通过非免疫库则较难筛选到针对小分子的高亲和力的纳米抗体。

 
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