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导致PCR失败的几种常见问题及解决方法

   日期:2019-05-03     来源:赛业生物    浏览:25    评论:0    
核心提示:首先,让我们来回忆一下PCR鉴定的整个过程,主要包括样本处理、配PCR体系、扩增、PCR产物电泳四个部分,接下来我们就从这几个部

首先,让我们来回忆一下PCR鉴定的整个过程,主要包括样本处理、配PCR体系、扩增、PCR产物电泳四个部分,接下来我们就从这几个部分盘点PCR操作中的那些坑,请收下这份防坑指南。

1.样本处理

PCR的第一个步骤就是处理样本,这一步出问题后面的也就废了。取样后,如果不能马上处理样本,短期放4℃保存,长期放﹣20℃保存;此外,加完裂解液,要注意检查样本是否完全浸没在裂解液中。

2.PCR体系

简而言之,PCR体系的要求就是“加对成分加对量”,就好比做一道菜,缺了任何一种材料或者量不合适,味道就不一样了,而对PCR而言,缺了任何一种成分或者量不对,你就别想看到漂亮的目标条带了。所以配体系的时候一定要专心,不要分心思考类似于今天中午吃什么这种哲学问题,注意所有的成分是否加对了,每种成分的量是否加对了。例如,酶的量很少,吸取的时候要注意有没有吸到。

3.PCR扩增

就扩增而言,关键是要设计对程序,主要就是退火温度及延伸时间。

退火温度根据引物的Tm值而定,延伸时间按所用的酶来计算。

4.PCR产物电泳

终于到了令人激动的时刻,扩增好就可以进行琼脂糖凝胶电泳出结果了。当然,在做之前你得提前把胶配好,胶的质量好坏也会影响结果。这个环节需要注意的就是选择合适的胶浓度,胶溶解加热时不要过久,水分蒸发过多浓度改变,但同时要保证胶溶解彻底。添加的染液要注意检查是否过期变质。倒好胶后插梳子,注意除去气泡,待胶凝固之后拔梳子要一气呵成,然后给样本加loading buffer,最后就可以上样啦。

这一步我们要注意以下几点:

  1. 可以每个孔加一点loading buffer检测胶是否有漏。特别是当你觉得胶可能破了的时候一定要进行验漏;
  2. 上样的时候枪头垂直加入,不要戳破胶孔,边加边抽出,防止喷涌出来,注意不要有气泡;
  3. 上一个样换一个枪头,防止污染;
  4. 电泳液多次使用的话,最好频繁更换,防止污染。

5.设置对照组

生物实验一定要做对照,没有对照就没有说服力,而且设置对照有利于分析PCR鉴定失败的原因。阴性对照及阳性对照所加体系与待测样本一样,只是加的样本分别为无菌水及同个品系野生型小鼠的基因组模板。

阴性对照的意义:若是阴性对照也P出了条带,说明有污染,实验结果不可靠。

阳性对照的意义:如果阳性对照也没P出来,说明体系、条件或是操作有问题。

接下来就给大家奉上几张失败的电泳图,分析一下PCR的常见问题以及改进的建议,PCR成功的原因只有一个,而失败的原因却千千万,真是让人头大,所以大家千万不要学我,每个步骤都要细心谨慎,祝大家都能跑出漂亮的条带。

常见问题及建议

1.没有条带

原因1.1 :样本。样本放置太久失效;样本裂解步骤出问题,比如组织没有浸没到裂解液中;样本有裂解到但是DNA浓度低,跟取样有关,毛发太多组织太少,会导致裂解不出太多DNA。

建议:当然是重新取样提取DNA了,取样大小适中,裂解时注意组织是否完全浸没到裂解液中。

原因1.2: PCR反应体系。少加酶、引物、dNTP、缓冲液等均会导致目标片段扩增不出来。

建议:配体系加样时,自行开启勿扰模式,心无杂念,心里默念:每种成分都加了吗?量都加对了吗?

原因1.3: 操作问题。比如是否把酶放置在冰上,常温放置过久会使酶失活;加各体系的时候,是否有吸取到再加进去。

建议:记住冰在酶在,即使是融酶也要放冰上融,拿手握住酶或是常温放置,被老板看见是要被打的。

2.抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

原因:往往是由于酶量过多或酶的质量差、dNTP浓度过高、Mg2+浓度过高、退火温度过低、或循环次数过多及引物不特异等引起的。

建议:减少酶量或换另一来源的酶;减少dNTP的浓度;适当降低Mg2+浓度;增加模板量;减少循环次数。最有效的方法就是提高退火温度,或者更换引物(引物不特异也会造成抹带)。

3.条带比较暗

原因3.1:酶。

建议:条带弱的情况加多酶量,一半都能得到改善。实验表明,PCR酶对DNA具有一定的偏好性,如果使用一种酶经过优化也难以获得理想扩增时,可以尝试别的PCR酶。

原因3.2:模板、引物。

建议:确保模板和引物的品质,保证没有降解。用合适的试剂盒回收样本,或者进行胶回收得到纯净的DNA样本是不错的选择,或者直接加多模板,提高反应体系中DNA的浓度。

原因3.3:反应体系与条件

建议:增强循环数、降低退火温度、适当升高Mg2+工作浓度,都可以提高扩增效率,但同时会导致特异性下降,需要根据具体的实验要求优化合适的条件。

PCR失败的原因千千万,操作情况因人而异,所以实验小白们在操作时可以请师兄师姐帮忙看一下,他们会发现许多你都注意不到的操作错误,及时纠正过来就好了,不然每次操作都出同样的错误,而自己又不知道错在哪,觉得自己是按着步骤和要求来做的啊,怎么就出问题了。

关于基因编辑小鼠PCR鉴定就讲这么多了,热烈欢迎大家在评论区留言,留下你的经验,帮助更多的科研狗吧!

原标题:论PCR失败的N种方法

 
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