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人工诱导多倍体的方法

   日期:2014-01-06     浏览:282    评论:0    
核心提示:人工诱导多倍体的方法主要有生物学方法、物理学方法和化学方法。1.生物学方法 主要采用杂交方法,尤其是种间杂交的方法获得异源多倍体。如刘思阳(1
人工诱导多倍体的方法主要有生物学方法、物理学方法和化学方法。
1.生物学方法 主要采用杂交方法,尤其是种间杂交的方法获得异源多倍体。如刘思阳(1987)用雌性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(2n=48)与雄性三角鲂(Megalobramq sp.)(2n=48)杂交,获得子一代的染色体数目为72的草鲂杂种三倍体。其中,草鱼提供了二倍体数目的染色体,三角鲂提供了单倍体数目的染色体。可见,雌性草鱼卵子第二极体的排放受到抑制。种间杂交抑制第二极体放出的机制尚不清楚,而种内杂交时,极少有不排出第二极体的现象发生。
2.物理学方法 诱导多倍体的物理学方法主要包括温度休克法、水静压法和高盐高碱法等。其中,温度休克法和水静压法较常用而且效果较好。
(1)温度休克法 根据处理温度的高低,温度休克法又分为冷休克法(0~5℃)和热休克法(30℃左右),即用略高于致死低温(冷休克)或略低于致死高温(热休克)来诱导三倍体(抑制第二极体排出)或四倍体(抑制第一次卵裂)。此法操作简便,不需特殊仪器、只要掌握好处理条件,既能获得较高的诱导率,所以广为采用。
最佳诱导条件因动物的遗传背景及卵子成熟度的不同而异,必须要优化的三个因素是处理时刻(即处理开始时间,一般从受精开始算起)、处理持续时间和处理温度。在黑纪????三倍体的诱导实验中发现,受精后5min,将受精卵置于4~5℃处理10~15min,然后转移到正常温度(17~20℃)下培养,黑纪???三倍体的诱导效果最好。处理温度不宜过高或过低,最好选择亚致死温度进行短期处理,以免影响胚胎的孵化率。一般说来,冷水性鱼类如鲑科(Salmonidae)鱼类采用热休克,温水性鱼类如鲤科(Cyprinidae)和纪????科(sparidae)鱼类采用冷休克效果好。也许是由于增强了刺激强度所致。但是,最近研究表明也不尽然,如鲤科鱼类用热休克同样也可以获得较高比例(80%~100%)的三倍体,香鱼(Plecoglossus altivelis)三倍体的诱导用冷休克和热休克均可获得满意的效果。
(2)静水压法 静水压法即采用较高的水静压(压力为630743225Pa,即650kg/cm2)来抑制第二极体的放出或者抑制第一次卵裂诱导多倍体的方法。此法诱导率高(一般都在90%~100%)。处理时间短(3~5min),对受精卵的损伤小,胚胎成活率高,因而备受青睐。但是,该法需要专门的设备(如水压机),成本较高,且样品室容量有限,不适于大规模生产。
(3)高盐高碱法 高盐高碱法是近几年才尝试的方法,采用高pH或高盐的条件来诱导产生多倍体,该法尚待进一步完善(参见本书第五章)。
3,化学方法 有些化学物质可用来诱导受精卵产生三倍体或四倍体。常用的有秋水仙碱、细胞松弛素B和PEG三种。另外,也用麻醉剂,如N2O和CHClF2等诱导大西洋鲑鱼受精卵获得较高比例的三倍体。但该法所需的化学药品一般较贵,且具有一定的毒性。
(1)秋水仙碱 秋水仙碱是从秋水仙中提取的一种植物碱,极毒,可抑制纺锤体的形成,在植物多倍体的诱导中被广泛采用。在动物中,因秋水仙碱处理容易形成嵌合体,且存活率低而不太常用。
(2)细胞松弛素B 细胞松弛素B是细菌的代谢产物,能抑制肌动蛋白聚合成微丝,干扰细胞质分裂。用10mg/L的细胞松弛素B(溶解于2.5%的DMSO)处理大西洋鲑鱼的受精卵,获得了二倍体、三倍体和四倍体的嵌合体。细胞松弛素B在鱼类上因诱导多倍体效果不好而几乎不被采用、但却是贝类诱导多倍体的最有效的方法。用0.05mg/L的细胞松弛B处理节???孔扇贝受精卵20min。可获得50%的三倍体。牡蛎(Ostrea)的某些三倍体是可育的。郭希明等(1994)通过分离二倍体牡蛎的卵子(n=30)与正常精子受精,然后用细胞松弛B处理,抑制其第一极体排出的方法,获得了可以生存的有繁殖能力的太平洋牡蛎四倍体。在生产上,通过四倍体与二倍体杂交获得三倍体是一条经济有效的大量生产三倍体苗种的理想育种途径。
(3)PEG 聚乙二醇(PEG)是一种常见的细胞融合剂。用PEG处理虹鳟精子,使精子细胞融合后,再与卵子受精,也获得了三倍体(双精受精)。
 
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