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细胞融合技术

   2014-01-06 1380
核心提示:诱导融合的方法可分为物理法、化学法及生物法。物理法主要包括显微操作、电场刺激等;化学法主要是用聚乙二醇PEG结合高pH、高钙离子法;生物法有仙台
诱导融合的方法可分为物理法、化学法及生物法。物理法主要包括显微操作、电场刺激等;化学法主要是用聚乙二醇PEG结合高pH、高钙离子法;生物法有仙台病毒法等。具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。诱导动物细胞融合,仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合法都适用;植物细胞融合常用PEG法和电融合法;微生物细胞融合只适用PEG法。
1 生物法——仙台病毒法
我们知道很多病毒都具有凝集细胞的能力,它一边黏接在一个细胞表面,另外一边黏接在另一个细胞表面,从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。
仙台病毒(Sendal virus)也称日本血凝病毒HVJ,属黏液病毒副流感类群,是RNA病毒,多型颗粒状,易在小鼠中蔓延。由于被感染细胞表面发生某些改变,使得这些细胞容易发生融合,甚至处死的HVJ病毒也具有促进细胞融合的作用。
20世纪60年代,日本仙台东北大学医学系的学者冈田(0kada)利用仙台病毒使两种不同的动物细胞之间发生凝集,进而融合成一体。在动物细胞融合中,仙台病毒(HVJ)已成为产生细胞杂种的标准融合剂。
仙台病毒具有促使凝结的细胞发生融合的能力,这是因为各种能被其作用的细胞均有相应受体的缘故。现已基本知道,其促进细胞融合的有效部位在于它的膜,被超声波打碎的病毒膜片仍具有促进细胞融合的功能。
病毒促使细胞融合的主要步骤如下:
(1)两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。
(2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透,胞质互相渗透。
(3)两个原生质体的细胞核互相融合,融为一体。
(4)进入正常的细胞分裂途径,分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。
2化学法(聚乙二醇)
细胞融合中的化学法诱导主要包括:NaN03诱导(NaN03可中和原生质体表面负电荷,促进原生质体聚集,对原生质体无损害,但融合效率低)、高Ca2+和pH诱导法、PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。上面几种方法中以后者最为常用,下面做一重点介绍:
(1) 基本原理
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一种多聚化合物,分子式为H(OHCH2-CH2)nOH,商品名卡波蜡(Carbowax)。实验室用的PEG平均相对分子质量在200~2000之间,一般1 000以下者为液体,1000以上者为固体。1974年人们用它诱导大麦、大豆等植物原生质体融合,以后又用PEG诱导与用高Ca2+和pH诱导相结合,极大地提高了融合效率。
这种多聚化合物靠醚键的联结使其分子末端带有弱电荷。PEG法诱导原生质融合的机制尚不十分清楚,初步分析可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键,促使异源的原生质体间的黏着而结合,用高Ca2+和pH溶液将与质膜结合的PEG分子进行洗脱,导致电荷平衡失调并重新分配,使两种原生质体上的正负电荷连接起来,进而形成具有共同质膜的融合体。
(2 ) 融合过程中应注意:
①事先要做好两种原生质体的识别标记,如色素、缺陷型、抗性标记等。
②原生质体的密度应在105个/mL左右,两种原生质体按1:1等量混合。
③常用PEG的分子量通常为4000~6000,加热熔化与Eagle溶液配成50%(W/V)浓度(小分子质量的PEG配成55%浓度)。加入PEG后,24℃培育10~20min
注意时间宜短不宜长,过长,使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体,会降低融合率),缓缓加入高pH、高钙离子溶液15min后用冲洗液清洗,离心收集原生质体。
(4)计算:融合率=(融合细胞的细胞核总数/视野内全部细胞的细胞核总数)×100%
3 物理法——电融合诱导法
(1)基本原理
电融合法是20世纪80年代出现的细胞融合技术。在直流电脉冲的诱导下,原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变,使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整的膜形成融合体。
与PEG法比较,电融合法优点较多,如融合率高、重复性强、对原生质体伤害小;装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程;免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。
(2)基本过程
电融合装置的电极有两种:微电极型和平行多电极型
①将制备好的亲本原生质体均匀混合放人融合小室中,微电极型只有一个小室,平行电极型有4个小室,两电极间隔3mm,整个装置放在一个培养皿中。
②微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜表面接触,微电极所产生的5~12mA的脉冲电流间断刺激1~5ms,原生质体在累计几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩,两层膜之间形成小孔,连接成桥,形成一个个泡囊,经点连接到面连接,最后形成融合体,整个过程大约10~30min。
③平行多电极通过1兆赫(MH2)交流电场发生双向电脉冲,原生质体在电场力的作用下,极化产生偶极子,原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度(如50mA l.2~2kV/cm)的直流电脉冲作用下,质膜被击穿,进一步形成融合体。
4. 细胞融合的影响因素
(1)植物细胞融合
植物原生质体融合五种属特异性,欹共融合效率仅与外界条仟有天,而与共自身种属无关。如何确定不同材料的融合条件,需经过具体实验制定出最佳融合方案。
①PEG诱导融合的关键是作用时间。
②PEG规格和纯度与融合效率。
③融合率与密度有关。
④其次交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲大小均会影响融合率。
⑤此外,用混合盐溶液对原生质体进行融合前预处理,以及在促融剂中添加伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜、胰蛋白酶、精胺或亚精胺等亦可提高融合效率。
(2)动物细胞融合
在动物细胞融合过程中,除促融剂外,其他如细胞性质、温度、pH、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。
①首先,亲本细胞表面性质影响较大,表面覆盖绒毛而不规则者较易融合,而表面光滑者较难融合。
②细胞种类不同,融合效果也不同,如腹水癌及株化细胞较易融合,而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。
③细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧利希氏腹水癌细胞融合时,于37 ℃ 振摇时易于融合,且融合效率与病毒量呈正比。但在34 ℃ 振摇则融合率下降。在37℃时不振摇则几乎不融合。
④细胞融合过程中,通常耗氧量较大,缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20%时有一定融合率,但有些细胞在无氧条件也可融合。
⑤有些细胞融合时需要Ca2+,否则不融合,细胞蛋白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+,但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/L。
⑥最适合的pH为7.4~7.8之间,在此范围之外,融合率均较低。
5. 融合细胞的选择
通过各种技术手段可以获得各种类型的融合体。细胞发生融合后,根据融合细胞中所含的类型,可将其分为以下几种类型:
(1)同核体——同源原生质体的融合体。由于是同源细胞,它们的基因型及表现型完全—样。
(2)异核体——非同源原生质体的融合体。一般是亲源关系较近的细胞,这种亲核杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质,其发育的个体也有可育的,如烟草种间的细胞杂种。
(3)多核体——含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合,融合体以一个细胞的核物质为主,只加人另外一个细胞少量的遗传物质。
在植物原生质体的融合过程中,除了产生双亲原生质体融合的异核体外,还能产生具有双亲不同比例的多核体、同源原生质体融合的同核体以及不同胞质来源的异胞质体等等。而且植物原生质体融合后,融合物在培养基中再生细胞壁,通过有丝分裂,产生由亲本细胞、同源细胞及杂种细胞组成的混合群体。
因此需要通过培养和筛选,除去不需要的细胞,分离出需要的杂种细胞,从而解沃融肯细体的筛选方案和选择体系,优先选择杂种纲胞,或只允许杂种细胞生长,以淘汰亲奉细胞。最简单的选择方法是利用双亲细胞形态和色泽上的差异识别杂种细胞,但多数是根据细胞生理遗传上的特性来选择。
6. 细胞融合应用
与植物细胞和微生物相比,动物细胞融合在原理上虽然和它们基本相同,但由于动植物细胞在细胞结构上的差异,在一些具体细节上仍有所不同:1978年瑞士科学家埃勒门斯和美国的柯路斯熔人的纤维肉瘤细胞与小鼠的畸胎瘤细胞融合后培育成含人体染色体的人造小鼠。近年来,杂交育种已成为培育动物新品种的一个有效手段。
自1975年英国剑桥大学的科学家利用动物细胞融合技术首次获得单克隆抗体以来,许多人类无能为力的病毒性疾病遇到了克星。用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异,鉴定细菌的种型和亚种。这些都是传统血清法或动物免疫法所做不到的,而且诊断异常准确,误诊率大大降低。例如,抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的单克隆抗体,其灵敏度比当前最佳的抗血清还要高100倍,能检测出抗血清的60%的假阴性。
单克隆抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体,对应于多克隆抗体/多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
  单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞产生的,这种融合细胞即具有瘤细胞不断分裂的能力,又具有免疫细胞能产生抗体的能力。融合后的杂交细胞(杂种瘤)可以产生大量相同的抗体。当其应用于医疗中时,在识别抗原中的显示的微小变化(如果有的话)有助于减小副作用。
  1975年,瑞士科学家乔治•克勒和英国科学家凯撤•米尔斯坦,把产生抗体的B淋巴细胞与多发性骨髓瘤细胞进行融合,形成杂交瘤细胞。这种细胞兼有两个亲代细胞的特征,既有骨髓瘤细胞无限生长的能力,又有B淋巴细胞产生抗体的功能。因此,这种杂交瘤细胞就能在细胞培养中产生大量单一类型的高纯度抗体。这种抗体叫“单克隆抗体”。
高等动物的免疫主要是机体能识别外源异物与自身的物质。例如种牛痘预防天花及接种麻疹疫苗预防麻疹已得到广泛应用。高等动物与外界相通的呼吸道及生殖泌尿系统等被称为外分泌的淋巴系统;不与外界棱触的胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体及淋巴结等称免疫内分泌淋巴系统。
发生融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征:即象骨髓瘤细胞一样在体外培养时能够无限地快速增殖,又能持续地分泌特异性抗体,通过克隆化可使杂交细胞成为单纯的细胞系,由此单克隆系就可以获得结构与各种特性完全相同的高纯度抗体,即单克隆抗体(McAb)。
动物细胞融合最具有价值的成就是利用杂交瘤技术生产单亢隆抗体。骨髓瘤细胞可以在体外培养生长,而且比正常细胞生长繁殖的速度要快。但是这种细胞不会产生抗体。用特定的抗原刺激正常小鼠的脾脏B淋巴细胞就会产生相应单一特异性抗体,但这种B淋巴细胞难以在体外培养。利用杂交瘤技术可以将这两种各具功能的细胞融合在一起,培养成既能产生单一抗体,又能在体外快速生长的杂交瘤细胞。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。
单克隆抗体的制备大致是按以下步骤进行:首先取得抗原(包括细菌、病毒或某种纯的蛋白)注射到小鼠体内,大约注射4次,使小鼠免疫并产生相应的抗体。取小鼠的血清与抗原作用,确认产生抗原—抗体凝集反应。取出免疫鼠的脾脏剖成脾细胞悬浮液,与鼠骨髓瘤细胞混合,加入聚乙二醇形成融合细胞,又叫杂交瘤。它具有分泌抗体又能迅速生长的特性,叫单克隆抗体杂交株。利单克隆抗体的诊断方法很多,如酶联吸附法(ELISA)、荧光抗体法、胶体金银染色法等已在临床诊断上应用。单克隆抗体制备基本方法:
(1)抗原提纯与动物免疫
对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4d,分离脾细胞融合。
(2)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/mL,倍增时间通常为10~15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105/ml,次日一般即为对数生长期细胞。
在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞(feeder cell)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。
在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/mL,提前一天或当天置板孔中培养。
(3)细胞融合
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG,消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等,常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中,第1min滴加4.5mL培养液;间隔2min滴加5mL培养液,尔后加培养液50mL。③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。
(4)有限稀释法
筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株,所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上(见图12-5)。融合细胞呈克隆生长,经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔),按Poisson法计算,应有36%的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0%~20%孔底时,吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔,将孔中细胞再行克隆化,尔后进行抗原特异的ELISA测定,选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
(5)单克隆抗体的制备和冻存
筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。另一种是体内增量,如实体瘤法,对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×107个/mL接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2mL,肿瘤达到一定大小后(一般10~20d)则可采血,从血清获得单亢隆抗体含量可达到1~10mg/mL,但采血量有限。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法(见图12-6),选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用0.5mL降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,1-2周后将1×106杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。按种细胞7-10天后可产生腹水,通常在接种一周后即有明显的腹水产生,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸人试管中,也可用注射器抽取腹水,可反复收集数次。每只小鼠可收集5~10mL的腹水,有时甚至超过40mL。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当,一般为5×105/鼠,可根据腹水生长情况适当增减。腹水中单克隆抗体含量可达5~20mg/mL,可以将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好,冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低,而冻存在-70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种,冻存过程中需格外小心。二甲亚砜(DMSO)是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50%~95%之间。如果低于50%,则说明冻存复苏过程有问题。
(6)单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化,腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高,纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的,也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法,多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用Sepharose)交联,制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可达90%以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合,同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测,小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时,1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
把单克隆抗体与抗癌药物或毒素结合起来,就成为威力强大的抗体“生物导弹”。把这种抗体“导弹”注射到癌症患者的血液中,它就会发挥导弹样的作用,在患者体内追踪并附着于癌细胞上,然后与抗体结合的抗癌药物或毒素杀伤和破坏癌细胞,而且很少损伤正常组织细胞。这种抗体“导弹”具有高度选择性,对癌细胞命中率高,杀伤力强的优点,没有一般化学药物那样不分好坏细胞,格杀勿论的缺点。美国约翰•霍普金斯医院应用抗体“导弹”治疗晚期肝癌病人,收到惊人效果。肝脏肿癌显著缩小,生存期延长,而且没有副作用。单克隆抗体技术的发明,是免疫学中的一次革命,打破了过去只能在身体内产生抗体的方法,而成功地在体外用细胞培养的方法产生抗体,同时繁殖快,可以产生在体内达不到的高滴度和高专一性的水平。它来自于每一个细胞,所以非常纯净。
单克隆抗体在疾病的诊断和治疗预防方面,与常规的抗体相比,特异性强,灵敏度高,优越性非常明显。单克隆抗体可以精确地检测排卵期。新一代免疫避孕药也在研制之中,其基本原理是用精子,卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体,将它们注入妇女体内,人体就会产生对精子的免疫反应,从而起到避孕作用。人类体外受精技术的日趋成熟,使人类对生育活动有了较大的选择余地,促进优生优育,提高人口素质,也为不孕症患者或不宜生育的人带来福音。
 
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