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酵母遗传学方法:酵母免疫荧光

   日期:2016-09-06     浏览:145    评论:0    
核心提示:  酵母免疫荧光  1)细胞制备  1.培养5ml酵母至对数生长早期(106~107细胞/ml)。  2.直接加1/10体积的甲醛到培养基里

  酵母免疫荧光

  1)细胞制备

  1.培养5ml酵母至对数生长早期(106~107细胞/ml)。

  2.直接加1/10体积的甲醛到培养基里固定细胞(加入的甲醛终浓度为3.7%,标准母液是37%)。

  3.细胞在甲醛中培养至少1小时。

  4.离心收集细胞,用0.1mol/L磷酸钾(pH7.5)洗一次。

  5.把细胞悬浮在1ml的50mg/ml消解酶100T或50单位/ml的溶细胞酶[溶于含有2ml/ml 6-巯基乙醇的0.1mol/L的磷酸钾溶液中]。

  6.置30℃培养30分钟,用相差显微镜检查原生质的生成率。细胞应呈黑色或半透明灰色,亮细胞(折射体)属于没有充分被消化的。菌蜕属消化过夜。

  7.离心收集细胞,悬浮在1ml的PBS中。

  2)染色

  1.取10ml的1mg/ml聚赖氨酸,放到用特氟隆封闭的(Teflonmasked slides)载玻片(10孔载玻片)上的每个孔,再用蒸馏水洗载玻片,干燥。

  2.放10ml固化细胞到每个孔中,几分钟后,用PBS抽洗3次。用显微镜检测载玻片确保呈合适的密度而不聚集。

  3.该步骤可任选(本实验不需要使用抗体,但建议使用):把载玻片浸泡在冷甲醇(-20℃)6分钟后,然后放到冷丙酮(-20℃)30秒,该处生理产生扁平细胞,有助于细胞骨架的观察。对于一些抗体-抗原结合物,需要这些步骤重新活化,用PBS重新润湿玻孔。

  4.加15ml由PBS+3%BSA(牛血清白蛋白)组成的阻断缓冲液到玻孔中。在保湿盒子中,如垫有湿纸巾的平板中保温30分钟。重要的是,在这期间不能让载玻片孔干透(BSA可通过阻断蛋白质结合位点降低非特异抗体结合到载玻片)。</P< p>

  5.吸出阻断缓冲液,用PBS+3%BSA洗两次。

  6.加10~15ml第一抗体(溶解在PBS+3%BSA)到载玻片孔中,在一个保湿盒中保温1小时。用亲和纯化抗体或单克隆抗体,如果可能,用缺乏目的抗原的同源对照。作一个没有第一抗体的对照也是有帮助的。

  7.吸出第一抗体,用PBS+3%BSA洗3次。

  8.用荧光第二抗体重复第6~7步(在暗处培养)。

  9.吸出第二抗体,用PBS+3%BSA洗3次。

  10. 加10~15ml的1μg/ml DAPI到载玻片孔中,培养约1分钟,用PBS洗3次。

  11. 吸出PBS,给每个孔加一小滴封固剂,放盖玻片,避免在孔中出现气泡。用纸巾除去多余的封固剂,小心不要移动盖玻片,用干净的指甲油密封,-20℃下保存。
 

 
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