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星型胶质细胞的纯化培养方法

   日期:2016-08-18     浏览:1170    评论:0    
核心提示:1. 分离大鼠胚胎(16-18周)新皮层,置于L-15(或Hanks平衡盐/DMEM溶液,无HEPES)培养基中,除去脑膜和血管、海马、尾核和其他非
1. 分离大鼠胚胎(16-18周)新皮层,置于L-15(或Hank’s平衡盐/DMEM溶液,无HEPES)培养基中,除去脑膜和血管、海马、尾核和其他非皮层组织。
2.  用解剖刀将其切成1mm3大小的组织块。
3.  用1ml枪头转移250μl胶原酶储存液(1.33%,溶于L-15中)到1ml的L-15(或D-MEM)中。每2只鼠脑组织块使用1-1.5ml稀释胶原酶液。
4.  37℃水浴中孵育30min.
5.  1000rpm(大约230g)中离心5min,或3000rpm(大约2000g)中离心1min。
6.  去上清。
7.  在含EDTA-CMF的溶液中重悬细胞,并与胰蛋白酶以1:4~1:10比例混合。可以根据观察到的细胞消化的情况,适当调整两者的比例。
8.  加入胰蛋白酶的抑制剂和DNase溶液,混合5分钟。
9.  1000rpm(大约230g)中离心5min,或3000rpm(大约2000g)中离心1min。
10.去上清。加入500μl D-MEM-BS。
11.轻轻吹打成单细胞悬液,开始用5ml枪头吹打10次,在需要时用18-gauge的针头吹打。( 注意:不要产生气泡。)200目/300目尼龙网过滤。
12.将细胞转移到含10%FCS-DMEM的培养瓶中,培养密度为2X106/25cm2培养瓶,4~6 X106/75cm3培养瓶。在37.2℃,37.5%中培养。
13.第2天换液,以后每隔3天换液。
14.7-10天,细胞发生融合。
15.细胞融合后,将瓶盖用封口膜密封好,在轨迹摇床上培养,旋转速度以不产生气泡为宜。37℃振摇过夜。细胞注意避光。
16.去上清,加入新鲜10%FCS-DMEM。
17.加入200μl 1mM的阿糖胞苷/10ml培养基。在37.2℃,37.5%中培养孵育48小时以消除分裂的细胞。
18.换用新鲜10%FCS-DMEM,孵育恢复24小时。
19.重复17-18步骤,消除所有的分裂细胞。
 
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