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CFP荧光蛋白文库构建及FRET技术筛选钙调素结合蛋白

   日期:2015-04-22     来源:中国细胞生物学学报    浏览:150    评论:0    
核心提示:孟凡力1,2 关 珊1 刘晓进1 李朝军3*(1南京师范大学生命科学学院, 南京 210023; 2南京医科大学基础医学院, 南京 211166; 3模式动物所, 江苏省分子医学生物技术重点实验室, 南京大学医学院, 南京 210093)钙离子作为细胞内重要的信号分子, 参与细胞内多种生理生化反应。它可以调控包括细胞增殖、发育、迁移、学习记忆等一系列生
孟凡力1,2 关 珊1 刘晓进1 李朝军3*
(1南京师范大学生命科学学院, 南京 210023; 2南京医科大学基础医学院, 南京 211166; 3模式动物所, 江苏省分子医学生物技术重点实验室, 南京大学医学院, 南京 210093)


钙离子作为细胞内重要的信号分子, 参与细胞内多种生理生化反应。它可以调控包括细胞增殖、发育、迁移、学习记忆等一系列生理活动[1-2]。钙调素(Calmodulin, CaM)作为钙离子的主要受体[1], 广泛存在于真核及原核生物中, 是一类在结构和功能上具有高度保守性的钙离子结合蛋白。CaM本身并没有酶活性, 但能够与靶蛋白结合并调节靶蛋白的活性从而使其发挥生物学功能。Ca2+/CaM信号在细胞周期调控中具有重要的作用, 它参与调控了细胞周期有丝分裂期的进入, 促进了核膜的破裂, 同时也调控了细胞分裂中后期的转换, 并且参与了胞质分裂的调控等。因此, CaM参与信号通路只能通过其与下游靶蛋白CaMBPs作用才能调节细胞功能[3]。为了更好地研究CaM在细胞周期调控中的重要作用, 我们试图找到CaM在周期细胞中的下游效应因子。在本研究中, 我们设计了一种新型的结合了Cre-loxP技术和荧光共振能量转移(FRET)技术的大规模筛选CaM结合蛋白的实验方法。

Cre-loxP系统是一种位点特异性重组, 发生在两条DNA链特异位点之间, 重组的发生需要一段同源序列即特异性位点和位点特异性的蛋白因子即重组酶Cre酶参与。Cre-loxP系统由于其简单易操作目前广泛受到青睐[4]。本实验所采用的是Clontech公司的Cre-loxP系统, 该系统采用基因的直接转移法,与传统的亚克隆技术相比, 不会引起目的基因的删减。另外, 它可以进行目的蛋白N-端或C-端标签。整个过程只需要一种重组酶, 操作简单方便。该系统利用了氯霉素抗性的正筛选和蔗糖的负筛选作为筛选标记。其原理是, 当发生Cre酶介导的重组反应时, 供体载体上的两个loxP位点之间的氯霉素抗性也一起转入受体载体中, 因而重组子上也含有氯霉素抗性。另外, 供体载体上含有一个sacB基因, 该基因能够编码一种将蔗糖转化为果聚糖的酶, 当含有该基因的菌在一定浓度的蔗糖培养基上生长时, 由于果聚糖积累在细胞周质空间, 而导致大肠杆菌死亡。因此, 我们可以利用氯霉素和蔗糖来筛选重组克隆。含有sacB基因的供体载体不能在蔗糖培养基里生长, 同样不能编码氯霉素抗性的受体载体也无法在氯霉素抗性中生长。这种双筛选的机制在理论上来说是可以保证99%的正确重组率。本实验拟通过Cre-loxP系统在体外构建一个带有青绿色荧光蛋白(CFP)标记的cDNA文库, 再利用FRET技术去筛选与CaM在特定的时空条件下发生相互作用的蛋白。

   19-15-39-39-3.pdf


中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2013, 35(12): DOI: 10.11844/cjcb.2013.12.0245
 
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