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流式荧光素的选择

   日期:2015-01-15     浏览:253    评论:0    
核心提示:为什么要推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢?因为这些荧光非常明亮,对激光非常稳定,适合流式细胞仪的光谱性质,对PH值不敏感,具有水溶性。此外,他们联合使用时发射光谱存在巨大差异,无需补偿。如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道,怎么办?如果需要做5个指标,而流式细胞仪只能做4个通道,首先将指标归成
为什么要推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢?
因为这些荧光非常明亮,对激光非常稳定,适合流式细胞仪的光谱性质,对PH值不敏感,具有水溶性。此外,他们联合使用时发射光谱存在巨大差异,无需补偿。

如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道,怎么办?
如果需要做5个指标,而流式细胞仪只能做4个通道,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,那么将样本分成两份,第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的,所以首先需要注意两点:
流式细胞仪有哪些激光。比如标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光,能做FL1、FL2、FL3三个荧光通道/三个颜色,而选配的Calibur (FACSCalibur的简称)配有488nm和635nm两根激光,可以检测FL1-FL4四个通道/4个颜色。
不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的,比如Calibur的FL3(第3通道)能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能检测PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能检测的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道检测。Calibur和LSR都能检测4个颜色,但是第4个通道检测荧光素是不一样的

搭配荧光素原则
搭配流式荧光素有2个原则:每个通道只能选择1种荧光素;各个通道之间的荧光素可以随意搭配,但需注意:
1、每个通道只能选择1种荧光素。以Calibur为例说明,Calibur的FL1通道选择了FITC就不能选择AlexaFluro488,或者选择了Alexa Fluro488就不能选FITC 。Calibur的FL3通道尽管能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五个荧光素,但是我们搭配的时候只能选择其中1个。
2、各个通道之间的荧光素可以随意搭配:如果客户的流式细胞仪能做4个通道,在第1个原则之下,那么每个通道随便选出1个荧光素就可以组合成4个颜色。以2跟激光的Calibur为例,Calibur各个荧光素之间可以搭配出16种组合。比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )+P E(F L 2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 这个搭配组合可以更改成Alex Fluro(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+Alex Fluro(FL4),或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PE-Cy5(FL3)+APC(FL4)等等。总之,在第1原则之下,我们可以随意搭配和组合各个荧光素。但是需要注意的是,APC和PE-Cy5一起使用的话,上流式以后,容易导致补偿过度。
 
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