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Blood Taq DNA聚合酶(免提取)

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品牌: Umibio
货号: D1010L1179
单价: 2450.00元/盒
有效期至: 长期供应
最后更新: 2017-08-23 14:31
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Blood Taq DNA聚合酶(免提取)

D1010L1179

200 tests

-20℃

550

 

 

 

 

 

Blood Taq DNA聚合酶(免提取)

D1010L1179

1000 tests

-20℃

2450

 

 

 

 

 

 

产品描述

 

Blood Taq DNA 聚合酶来源于携带有突变的 Taq DNA 聚合酶基因的 E. coli 菌株,是截短后的 Taq DNA 聚合酶,缺失了 N 端的 5´结构特异性核酸内切酶结构域,缺失了 N 端的 280 个氨基酸;此外其基因内部发生了三个点突变。这些突变使它能够耐受全血中存在的抑制剂, Blood Taq DNA 聚合酶其他性能与常规 Taq DNA 聚合酶没有较大差异。此酶能够扩增人和小鼠全血样品中的 DNA 而无需事先提纯。Blood Taq DNA 聚合酶在 25 µL 反应体系中能够耐受高达 20%的全血(50 µL 反应体系中耐受 30%)。

Blood Taq DNA 聚合酶较其他同类产品单位活性高,单位反应成本低。

使用 Blood Taq DNA 聚合酶扩增人全血。1:5%血液+Na-EDTA;2:5%血液+K-EDTA;3:5%血液+ Na-肝素;4:5%血液+Na-柠檬酸;5:含有人干血的 1mm2 FTA GutherieCard;6:含有人干血的 1mm2 FTA Card(50 µL 水洗)。

 

运输与保存方法

 

冰袋运输。收到货后-20℃避光干燥保存,1年有效。

 

使用方法

 

1. 反应体系配制。各组分在冰上完全融化、混匀,按照下表进行加样:

 

 

组分

25 µL

50 µL

终浓度

 

 

 

 

5X Bloot Taq Reaction Buffer

5 µL

10 µL

1X

 

 

 

 

10 mM dNTP

0.5 µL

1 µL

0.2 mM

 

 

 

 

 

10

µM Forward Primer

0.75 µL

1.5 µL

0.3 µM (0.05-1 µM)

 

 

 

 

 

10

µM Reverse Primer

0.75 µL

1.5 µL

0.3 µM (0.05-1 µM)

 

 

 

 

Whole Blood

up to 2.5 µL*

up to 10 µL**

 

 

 

 

 

Blood Taq DNA

2 µL

4 µL

 

 

 

 

 

Nuclease-free H2O

to 25 µL

50 µL

 

 

* ≤10% Recommended in 25 µL reaction volume. ** ≤=20% Recommended in 50 µL reaction volume.

 

1. 加血液样品。先将其它组分用移液器上下混匀,然后将血液加在管子底部。

 

2. 将 PCR 管转移至 95°C 预热的 PCR 仪,开始循环。

 

注:若反应体系中包含>10%的血液,推荐用 50 µL 反应体系。 4. PCR 反应。推荐 PCR 程序:通常为 30-40 个循环:

 

步骤

温度

时间

 

 

 

Initial Denaturation

95°C

3 minutes

 

 

 

30-40 Cycles (Typically 35)

95°C

20 seconds

 

50-68°C

30 seconds

 

68°C

2minutes per kb

 

 

 

Final Extension

68°C

10 minutes

 

 

 

Hold

4-10°C

 

 

 

 


注意事项

 

1. DNA 模板: 全血样品推荐用肝素钠、Na-EDTA、K-EDTA 或者柠檬酸钠处理,虽然 Blood Taq DNA 聚合酶可以耐受 30% (v/v)的全血样品,但为了达到最佳扩增效果,5%–10%为建议的理想样品量。干血如果存放在 Guthrie 卡或者 903 卡上(Whatman, NJ),可以直接在 25µL 反应体系内加入 1mm punch disc。如果血液存放在 FTA paper (Whatman, NJ), 则先把 1mm punch disc

在 50µL dH2O 中,50°C 条件下孵育 5 分钟,然后弃去 50µL dH2O,把 disc 直接放入 25 或 50µL PCR 反应体系中。

 

2. 引物:理想引物长度在 20–30 个核苷酸,GC 含量 40–60%。可用计算机软件辅助进行引物设计,诸如 PrimerSelect™ (DNAStar Inc, Madison, MI)或者 Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3)等软件在引物设计和分析时均表现良好。每个引物在反应体系中的终浓度为 0.05–1μM, 0.3μM 时表现更佳。

 

3. dNTPs: 每种 dNTP 推荐浓度为 200 µM。

 

4. 冷敏感: Blood Taq DNA 聚合酶增加了冷敏感性,包含部分热启动酶(Hot Start Taq)的特点,将反应体系至于冰上操作,并迅速置于 95°C 预热的 PCR 仪可以将非特异性扩增降至最低。

 

5. 变性温度和时间: 在正式开始 PCR 循环前,先进行 95°C,3 分钟的预变性,可以确保血细胞得到充分裂解并释放出 DNA

 

模板。

 

6. 退火温度和时间: 推荐退火时间持续 30 秒到 1 分钟,退火温度可以通过梯度 PCR 进行优化。梯度 PCR 时,退火起始温度低于计算出 melting temperature (Tm)5°C。

 

7. 延伸时间: 推荐延伸温度为 68°C,最后的延伸程序推荐为 10 分钟,68°C。Blood Taq DNA 聚合酶延伸速度为 500bp/min.

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