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人 MTHFR 和 MTRR 基因检测试剂盒

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品牌: Umibio
货号: 0000
单价: 1.00元/盒
有效期至: 长期供应
最后更新: 2017-08-22 17:19
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MTHFR 和 MTRR 基因检测试剂盒(荧光 PCR 法)说明书

 

 

【产品名称】

 

通用名称: MTHFR  MTRR 基因检测试剂盒(荧光 PCR 法)

 

【包装规格】 48 人份/盒

 

【预期用途】本试剂盒用于定性检测人全血和唾液样本中亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因 C677T 位点、

 

A1298C 位点和甲硫氨酸合成酶(MTRR)基因 A66G 位点的基因多态性,进行基因分型。

 

【检验原理】 本试剂盒采用 TaqMan-MGB 探针技术,对人类 MTHFR  MTRR 基因 3 个多态性位点,设计 3

 

套特异性引物和探针组合,在一个反应体系中通过两种不同通道对检测一个位点的基因多态性。

 

主要组成成分

 

序号

名称

主要组成成分

规格(48 人份/盒)

 

 

 

 

 

 

PCR 缓冲液、A1298C 引物和探针、内

 

1

反应液 A

标引物和探针

1×960μL

 

 

 

 

 

 

PCR 缓冲液、C677T 引物和探针、内标

 

2

反应液 B

引物和探针

1×960μL

 

 

 

 

 

 

PCR 缓冲液、A66G 引物和探针、内标

 

3

反应液 C

引物和探针

1×960μL

 

 

 

 

 

 

A1298C-AA 和 A1298C-CC、C677T-CC

 

4

阳性对照

和 C667T-TT、A66G-AA 和 A66G-GG、

1×100μL

 

 

质粒混合液

 

 

 

 

 

5

阴性对照

H2O

1×100μL

 

 

 

 

【储存条件及有效期】 试剂盒于-20℃±5℃避光贮存,有效期为 12 个月。

 

【适用仪器】 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪。

 

【样本要求】 本试剂盒适用于从全血和唾液样本中提取人类基因组 DNA 进行检测。

 

【检验方法】

 

1. PCR 前处理

 

a) 试剂配制(试剂准备区)

 

1) 从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温,各组分充分融解,涡旋混匀,瞬时低速离心。

 

2) 核算当次实验所需要的反应数(N),按照 20μl/孔的分装量将 3 种反应液分装到 N 个 PCR 反应管内。

 

PCR 反应管通过传递窗转移至样本处理室,剩余试剂放回-20℃±5℃冰箱避光保存。

 

N=(样本数+阴性对照(1T)+阳性对照(1T))×3。

 

b) 样本提取(样本准备区)

 

参考所购买的商用基因组 DNA 提取试剂盒说明书进行操作。

 

c) 加样(样本准备区)

 

将待测样本的基因组 DNA、阴性对照、阳性对照分别加入已装有 3 种反应液的 PCR 反应管,加入量为 5μl/


孔。

 

2. PCR 扩增

 

将准备好的PCR反应板或反应管放置在仪器样本槽相应位置,并记录放置顺序。按表3设置仪器扩增相关参数:

 

表3:仪器扩增相关参数

 

 

 

步骤

温度

 

时间

循环数

 

 

 

 

 

 

 

 

1

预变性

95℃

 

5 min

1 cycle

 

 

 

 

 

 

 

 

2

变性

95℃

 

10 s

40

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

退火、延伸及检测荧光

60℃

 

45 s

cycles

 

 

 

 

 

 

 

 

步骤 3 收集荧光信号,检测通道:FAM、VIC、ROX

 

 

 

 

 

 

 

*注:passive reference  和 quencher处均选择“none”。

 

 

 

3. 基线和阈值设定

 

反应结束后,根据扩增曲线,设定合适的基线(baseline)和荧光阈值(Threshold)。baseline 设为 3-15 (根据实际情况,baseline Cycler 可在一定范围内变化),荧光阈值一般设定在扩增曲线指数增长期的拐点,得到不同通道的 Ct 值。

 

4. 质量控制

 

阴性对照检测结果应为:三个反应体系中 FAM、VIC、ROX 均无扩增曲线,且 Ct 显示为 Undet;阳性对照检测结果应为:三个反应体系中 FAM、VIC、ROX 通道有扩增曲线,且 Ct 值≤33。

5. 试验结果的判定

 

在三个反应体系中对照均正常的情况下,结果判断如下:

 

表4:结果判定

 

反应液

基因型

FAM通道

VIC通道

ROX

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AA

Ct<38

Ct≥38

Ct<38

 

 

 

 

纯合野生

 

或无Ct值

 

反应液A (A1298C)

AC

Ct<38

Ct<38

Ct<38

 

 

杂合突变

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CC

Ct≥38

Ct<38

Ct<38

 

 

 

 

纯合突变

或无Ct值

 

 

 

CC

Ct<38

Ct≥38

Ct<38

 

 

 

 

纯合野生

 

或无Ct值

 

 

CT

Ct<38

Ct<38

Ct<38

反应液 B (C677T)

 

杂合突变

 

 

 

 

 

 

 

 

TT

Ct≥38

Ct<38

Ct<38

 

 

 

 

纯合突变

或无Ct值

 

 

 

AA

Ct<38

Ct≥38

Ct<38

 

 

 

 

纯合野生

 

或无Ct值

 

反应液C (A66G)

AG

Ct<38

Ct<38

Ct<38

 

 

杂合突变

 

 

 

 

 

 

 

 

 

GG

Ct≥38

Ct<38

Ct<38

 

 

 

 

纯合突变

或无Ct值

 

 


 

待检样本内标 ROX 通道 Ct 值如果≥38,则需对核酸提取物进行重复检测,如仍≥38,则需重新对样本进

 

行提取或者重新采样提取后进行检测。

 

【参考值区间】根据临床样本检测结果的数据统计确定参考值范围,并通过大量样本的检测结果对该参考值进

 

行确认。结果根据表 4 进行判定。

 

【检验结果的解释】

 

本试剂盒的检测结果仅供临床参考,对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及及治

 

疗反应等情况综合考虑。试验过程中可能受到以下因素的影响:

 

1. 不合理的样本采集、转运及处理导致的检测样本中被检核酸浓度含量低于最低检测限,会导致结果判读的错误;

 

2. 实验室环境污染,试剂污染,样品交叉污染也会导致结果判读错误;

 

3. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,会出现与实际不符的结果。

 

【检验方法的局限性】

 

1. 本试剂盒的检测结果仅供临床参考,对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

 

2. 模板 DNA 的质量可能受样本来源、采集过程、运输条件、样本处理等因素影响,同时也受 DNA 提取方法、PCR 仪类型、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等的限制,可能导致出现假阳性和假阴性的检测结果。

 

3. 有关假阴性结果的可能性分析:

 

不合理的样本采集、转运及处理、样本浓度过低均有可能导致假阴性结果。待测靶序列的变异或其它原因导致的序列改变可能会导致假阴性结果。

 

4. 低于产品最低检测限的样本无法检出。

 

【产品性能指标】

 

1. 本试剂盒最低检出限:1×102 copies/μL。

 

2. 分析特异性:和人类其它基因位点不发生交叉反应。

 

4.  精密度:用精密度参考品进行检测(n=10),检测结果 Ct 值的变异系数(CV,%)均<5.0%。

 

【注意事项】

 

1. 试剂盒使用前应仔细阅读说明书。

 

2. 本试剂盒不含人源性组分。

 

3. 本试剂盒为体外检测试剂。操作人员应经过专业培训并具有一定经验。

 

4. 实验严格分区操作,各区物品、工作服均为专用,不得交叉使用,避免污染,实验后请立即清洁工作台。

 

5. 本产品使用前应在室温充分融化,混匀并瞬时低速离心。

 

6. 冻存的DNA样本,加样前应在室温充分融化、混匀并瞬时低速离心后使用。

 

7. 本试剂盒所涉及的待测样本应视为具有传染性物质,操作和处理均需符合卫生部《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》相关要求。

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