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人 Y 染色体微缺失基因检测试剂盒(荧光 PCR 法)

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品牌: Umibio
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最后更新: 2017-08-22 17:15
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a说明书

 

 

【产品名称】

 

通用名称: Y 染色体微缺失基因检测试剂盒(荧光 PCR 法)

 

英文名称:Human Y Chromosome Microdeletion Gene Detection Kit

 

【包装规格】48 人份/盒

 

【预期用途】

 

根据国际卫生组织调查数据,约 15%育龄夫妇存在生育障碍,其中因男性因素引起的约占 50%,而 Y 染色

 

体微缺失即是导致男性不育的重要因素。在无精症或少精症患者中,Y 染色体微缺失发病率在 10~15%,已成

 

为男性不育患者的常规检查项目。Y 染色体上的精子生成因子(azoospermia factor,AZF)座位微缺失是男性原

 

发性不育的一个重要遗传因素,2013 版欧洲男科学会(EAA)和欧洲分子基因诊断质量联盟(EMQN)发布 Y

 

染色体微缺失检测指南,推荐检测 6 个 STS 位点,包含基因家族有 AZFa、AZFb、AZFc 三个区域,其中任何

 

一个区域的微缺失都能导致精子生成障碍。

 

本试剂盒用于定性检测人全血样本中 Y 染色体 AZF 区域中 6 个 STS 位点的缺失情况,从而指导不育男性

 

和患有无精症、严重少精症患者的遗传咨询,辅助植入前和产前诊断,具有很高的临床应用价值。本试剂盒仅

 

用于临床辅助诊断,不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。

 

【检验原理】

 

本试剂盒采用荧光 PCR 方法的原理结合 TaqMan 荧光探针技术,针对人类 Y 染色体 AZF 区域中 6 个 STS

 

位点 sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255 设计 6 套特异性引物和探针组合,同时针对 SRY 基因和 β-

 

珠蛋白基因(HBB)保守区域设计特异性引物和探针作为内参对样本的采集、DNA 的提取及扩增进行监控。

 

主要组成成分

 

序号

试剂名称

主要组成成分

装量规格

 

 

 

 

1

反应液 1

PCR 缓冲液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物、探针

1 管(960μl)

 

 

 

 

2

反应液 2

PCR 缓冲液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物、探针

1 管(960μl)

 

 

 

 

3

阳性对照

正常男性基因组 DNA

1 管(100μl)

 

 

 

 

4

阴性对照

正常女性基因组 DNA

1 管(100μl)

 

 

 

 

5

空白对照

TE buffer

1 管(100μl)

 

 

 

 

【储存条件及有效期】

 

1. 试剂盒于-20℃±5℃避光贮存,2 种反应液反复冻融不宜超过 15 次,试剂开封后请于 2 个月内使用。

 

2. 采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封进行运输,运输时间不宜超过 7 天;

 

3. 试剂盒在正确储存条件下有效期为 12 个月。生产日期和使用期限见产品标签。

 

【适用仪器】

 

ABI7500 荧光定量 PCR 仪。

 

 

【样本要求】


 

本试剂盒适用于从抗凝全血(不可用肝素)中提取人类基因组 DNA 进行检测,-20℃保存,避免反复冻融。

 

样本采集后应及时进行处理及检测,在 2℃~8℃可保存 7 天,置于≤-20℃条件下可保存 1 年,避免反复冻融。

 

样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。

 

【检验方法】

 

1. PCR 前处理

 

1.1 试剂准备(试剂准备室):

 

1) 从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温,各组分充分融解,涡旋混匀,瞬时低速离心。

 

2) 核算当次实验所需要的反应数(N),按照 20μl/孔的分装量将 2 种反应液分装到 N 个 PCR 反应管内。PCR

 

反应管通过传递窗转移至样本处理室,剩余试剂放回-20℃±5℃冰箱避光保存。

 

N=(样本数+阴性对照(1T)+阳性对照(1T)+空白对照(1T))×3

 

1.2 样本准备(样本处理室):

 

1) 样本 DNA 提取:参考所购买的商用基因组 DNA 提取试剂盒说明书进行操作。

 

推荐使用天根生化科技(北京)有限公司血液基因组提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit,DP318),

 

用于血液基因组 DNA 的提取。

 

2)加样:将待测样本的基因组 DNA、阴性对照、阳性对照、空白对照分别加入已装有 2 种反应液的 PCR 反

 

应管,加入量为 5μl/孔。盖好 PCR 反应管盖,记录样本加样情况。瞬时低速离心,将 PCR 反应管转移到

 

核酸扩增区进行上机检测。若 PCR 反应管内加入模板后不能立即上机,建议将加好模板的 PCR 反应管置

 

于 2~8℃暂时保存,并在 24 小时内尽快上机检测。

 

1. PCR 扩增(PCR 扩增室):

 

将准备好的PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置,并记录放置顺序。按表1设置仪器扩增相关参数:

 

表1:仪器扩增相关参数

 

 

阶段

温度

时间

 

 

 

 

 

预变性

95℃

5 min

PCR 反应条件

 

 

 

变性

95℃

10 s

 

 

 

 

 

 

退火、延伸及检测荧光

60℃

45 s

 

 

 

 

 

3. 基线和阈值设定

 

反应结束后,根据扩增曲线,设定合适的基线(baseline)和荧光阈值(Threshold)。baseline 设为 3-15 (根据实际情况,baseline Cycler 可在一定范围内变化),荧光阈值一般设定在扩增曲线指数增长期的拐点,得到不同通道的 Ct 值。

4. 质量控制

 

1)阴性对照:反应液 2 中 JOE 通道有扩增曲线,其他通道均无扩增曲线且 Ct 显示为 Undet。2)阳性对照:2 管反应液中 4 个信号通道均有扩增曲线,且 Ct 值<32。

 

3)空白对照:2 管反应液均无扩增曲线且 Ct 显示为 Undet。

 

5. 检测结果的判定


在阴性对照、阳性对照和空白对照均正常的情况下,结果判断如下:

 

表2:结果判定

 

反应液种类

检测位点

信号通道

存在

缺失

 

 

 

 

 

 

SY14(SRY)

JOE

Ct<38

Ct≥38

 

 

 

 

 

反应液 1

SY84

CY5

Ct<38

Ct≥38

 

 

 

 

SY134

ROX

Ct<38

Ct≥38

 

 

 

 

 

 

 

SY255

FAM

Ct<38

Ct≥38

 

 

 

 

 

 

SY86

CY5

Ct<38

Ct≥38

 

 

 

 

 

反应液 2

SY127

ROX

Ct<38

Ct≥38

 

 

 

 

SY254

FAM

Ct<38

Ct≥38

 

 

 

 

 

 

 

内标

JOE

Ct<38

Ct≥38

 

 

 

 

 

 

待检样本内标 JOE 通道 Ct 值如果≥38,则需对核酸提取物进行重复检测,如仍≥38,则需重新对样本进

 

行提取或者重新采样提取后进行检测。

 

【阳性判断值】

 

根据临床样本检测结果的数据,基于 ROC 曲线分析方法统计确定阳性判断值,并通过大量样本的检测结

 

果对该阳性判断值进行确认。

 

【检验结果的解释】

 

当检测过程中不合理的样本采集、转运及处理导致的检测样本中被检核酸浓度含量低于最低检测限,会导

 

致结果判读的错误。实验室环境污染,试剂污染,样品交叉污染也会导致结果判读错误;试剂运输,保存不当

 

或试剂配制不准确引起的试剂检测性能下降,会出现与实际不符的结果。

 

【检验方法的局限性】

 

1. 本试剂盒的检测结果仅供临床参考,对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

 

2. 模板 DNA 的质量可能受样本来源、采集过程、运输条件、样本处理等因素影响,同时也受 DNA 提取方法、PCR 仪类型、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等的限制,可能导致出现假阳性和假阴性的检测结果。

 

3. 有关假阴性结果的可能性分析:

 

不合理的样本采集、转运及处理、样本浓度过低均有可能导致假阴性结果。待测靶序列的变异或其它原因导致的序列改变可能会导致假阴性结果。

 

4. 低于产品最低检测限的样本无法检出。

 

【产品性能指标】

 

1. 本试剂盒最低检测限:1×102 copies/μl。

 

2. 分析特异性:和人类其它基因位点不发生交叉反应。

 

3. 准确度:采用企业阳性参考品对试剂盒进行检测,其阳性符合率 100%。


4. 精密度:本试剂盒的批内和批间的精密度参考品 Ct 值的变异系数均≤5.0%。

 

【注意事项】

 

1. 试剂盒使用前应仔细阅读说明书。

 

2. 本试剂盒为体外检测试剂。操作人员应经过专业培训并具有一定经验。

 

3. 整个实验过程应分三个区域进行(试剂准备区、样本处理区、PCR 扩增区),请严格分区操作;各区专用的仪器、设备、耗材和工作服均为专用,不得交叉使用;避免污染,实验后请立即清洁工作台。

4. 本产品使用前应在室温充分融化,涡旋混匀并瞬时低速离心。

 

5. 每次实验应设置阴性对照和阳性对照,于有效期内使用试剂盒。

 

6. 冻存的 DNA 样本,加样前应在室温充分融化、涡旋混匀并瞬时低速离心后使用。

 

7. 反应液分装时尽量避免产生气泡,放入扩增仪前应检查各 PCR 反应管是否盖紧,避免对仪器及环境的污染。

 

8. 本试剂盒所涉及的待测样本应视为具有传染性物质,操作和处理均需符合卫生部《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》相关要求。

 

【参考文献】

 

[1]Tavalaee M, Deemeh MR, Arbabian M et al. Density gradient centrifugation before or after magnetic-activated cell sorting: which technique is more useful for clinical sperm selection〔J〕.J Assist Reprod Genet, 2012, 29 (1): 31-38. [2]Simoni M,Bakker E,Krausz C. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004 [J]. Int J Androl,2004,27(4):240-249.

 

[3]Stahl PJ, Masson P, Mielnik A, et al. A decade of experience emphasizes that testing for Y microdeletions is essential in American men with azoospermia and severe oligozoospermia [J].Fertil Steril,2010,94(5):1753-1756. [4]Imeken L,E1 Houate B,Chafik A,et al.AZF microdeletions and partial deletions of AZFc region on the Y chromosome in Moroccan men[J]. Asian J Androl, 2007, 9(5): 674 – 678.

 

【基本信息】

 

 

【医疗器械注册证书编号/产品技术要求编号】

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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