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抗体质量问题

放大字体  缩小字体 发布日期:2016-12-27  来源:labome  浏览次数:22
Mary Johnson1 (mary at labome dot com), Haijian Pan2 (ouchappy at sjtu dot edu dot cn)
1 Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States. 2 Department of Food Science & Technology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China
译者 潘海建, 上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系
日期 更新 : 2015-02-25; 原始版 : 2014-01-23
引用 实验材料和方法 2014;4:572
摘要:本文通过汇总多篇报道抗体质量问题的文章,揭示了科学研究中使用的抗体存在严重的质量问题。 
英文摘要:A literature review of articles addressing the critical quality issue of research antibodies.

商品化的抗体在科学研究、诊断和治疗中有广泛应用。在全世界,诊断和治疗用的抗体得到健康卫生管理部门的严格监控。然而研究用的抗体没有一个标准或者第三方的质量控制。商品化的抗体往往不像广告中介绍的那么有效。不同批次的商品化抗体在特异性和性能方面往往有所差别 [1, 2] 。科研人员已经意识到这一重要质量问题。多年来,他们在各种环境下评估研究抗体,并发表了他们的发现。本文对这些评估文章做了综述,此外,还总结了导致抗体质量问题的原因。

抗体质量问题有多严峻?

大多数商品化抗体是通过亲和纯化的,然而我们并不知道到它们是否满足特异性的要求。治疗和诊断抗体的出售受到联邦机构的监督,然而研究用的抗体质量鉴定在市场上并没有统一或者强制的标准 [3] 。科研人员经常被没完没了的ChIP实验结果重复不出来 [4] 或者阴魂不散的“既无背景又无多肽条带”的Western结果 [5] 搞得焦头烂额。已有作者甚至不得不为抗体质量的问题撤回他们的论文, 由于使用的抗新的标记的抗体被发现在不含该标记的突变小鼠中也能染出条带 [6-8] 。

表-列出了一些强调抗体质量问题的研究成果。 Finstad, C. L.等证明一些批次的p-糖蛋白单抗C219和JSB-1对A型血决定因子在ELISA和免疫组化实验中存在交叉反应 [9] 。Mechetner, L等人报道称商品化的组蛋白H1抗体的每11个CDR中就有将近一个被“搭车抗原”(hitchhiking antigen)占据了 [10] 。 Michel 等人从7篇科研文章中综述了抗G蛋白关联受体的19个亚型的49个抗体缺乏选择性,并强调这一非特异性现象好像并非仅在G蛋白关联受体抗体中存在 [11] 。更令人惊讶的是,Egelhofer, T. A. 等人检测了组蛋白修饰研究中使用的抗体,发现超过25%的抗体没有通过斑点杂交和免疫沉淀特异性测试,超过20%没通过ChIP的特异性测试 [12] 。他们的研究发布到了网上,新的组蛋白抗体特异性测试也可以传到该网站:http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/。与之相似,更早之前,一个由Sylvia M Major等人开发的开放获取数据库AbMiner提过了600多个抗体的Western测试结果 (http://discover.nci.nih.gov/abminer/) [13] 。

抗体 数量 供应商(抗体数量) 评估方法 总结 参考文献
单抗和多抗 12929 9816个来自Atlas的亲和纯化的兔多抗和3113个来自13位科学家和48个其他供应商的单抗和多抗 免疫沉淀, 免疫组化 在起初的免疫沉淀分析中, 12,929个抗体中有45%有阳性染色,其他的没有染出条带(12%)或者条带大小错误(43%);在3113个非Atlas来源的抗体中,对应的数据分别为48%, 18%,和33%。此外,在原来在WB中不能得到阳性条带的Atlas抗体中,有82%在过表达的HEK293T细胞溶解物中选择性识别了他们的靶标,也就是说超过90%的Atlas抗体最后通过了WB的验证。3364个抗体在RT-4和U-251MG细胞系样品中进行了免疫沉淀和免疫组化验证的比较,Atlas抗体组的免疫组化反应性非常低,约60%对应的免疫沉淀分析并没有条带;免疫组化强反应的抗体组中,50%的测试抗体有阳性免疫沉淀条带。(注:本文作者隶属于Atlas抗体供应商。) [14]
抗细胞蛋白的商品化抗体 1725 SCBT (479), BD (418), HM (224), ENZO (178), EXB (86), HPA (79), ABN (61), 等 多重免疫沉淀(multiplexed IP),大小排除色谱分离MAP(size exclusion chromatography-resolved MAP (SEC-MAP)) 本文指出仅有25%的商品化抗细胞蛋白抗体通过了SEC-MAP测试 [15]
抗一系列抗原的单抗 >600 均为商品化抗体 免疫沉淀 70%的单克隆抗体有一个单一的主条带,其他的有些质量可能还行,有些质量可能不行。AbMiner数据库是免费的 [13]
组蛋白修饰抗体 246 Abcam (112), Millipore (36), Upstate (23), Active Motif (22), Diagenode (18) 等 免疫沉淀、斑点杂交 、ChIP-chip或者ChIP-seq分析 超过25%没有通过斑点杂交或免疫沉淀的特异性测试。在这些特异性的抗体中,又有超过20%没有通过ChIP测试。 [12]
G蛋白关联受体抗体 49 - 免疫组化、免疫细胞等 本文综述了七篇检测G蛋白关联受体抗体选择性的文章 [7, 8, 16-20] 这些抗体均没有选择性。它们指出G蛋白关联受体抗体和其他一些受体抗体缺乏选择性这一现象看起来并非特例而是普遍存在的。 [11]
修饰组蛋白尾抗体 36 - Celluspots peptide arrays 他们制备的多数抗体都能结合到修饰组蛋白尾上,但是有些却不能。一些抗体有很强的交叉反应活性。 [21]
一些癌症诊断抗体 32 Cell Signalling (3), DakoCytomation (3), BD Biosciences (2), Abcam (2) 等 免疫沉淀, 免疫组化 本文检测的32个抗体中,只有19个在两个评估分析方法中有可靠的特异性。本文介绍了一种新的抗体评估的方法。 [22]
抵抗素样分子(RELM)抗体 14 Roger Johns博士实验室 (3), R&D Systems (2), Santa Cruz (1), Chemicon (1) 免疫沉淀, 免疫荧光 一些抗体在免疫沉淀中有交叉反应, 另外的在免疫荧光实验中没有特异性。 [23]
抗组蛋白H3修饰抗体 8 Cell Signaling Technologies (4), Abcam (3), Millipore (1) 质谱分析 本文利用质谱分析法展现了一种定量检测多个商品化的ChIP级抗体质量的方法。考虑到常用的组蛋白修饰抗体可能存在交叉反应问题,ChIP的实验结果需要谨慎对待。 [24]
肌浆球蛋白重链亚基抗体 7 Schiaffino等(4), Alexis Biochemicals (2) 免疫沉淀, 免疫组化 在大鼠和人中,肌浆球蛋白重链亚基抗体在免疫组化和免疫沉淀试验中均缺乏特异性。肌浆球蛋白重链亚基抗体针对不同亚基的反应特异性需要认真评估,不仅是在不同物种之间,使用的方法不同结果也可能有差别。 [25]
大麻受体2型抗体 7 Sigma (2), Ken Mackie等(2), Pierce Biotechnology (1), Cayman Chemical (1), Pierce Biotechnology (1) 免疫沉淀, 免疫组化 许多常用的CB2R抗体在免疫组化实验中没有特异性。一些抗体不同批次之间的差别很大。所以在以后用CB2R抗体的时候一定要谨慎。 [26]
血管紧张肽II AT1受体抗体 6 Santa Cruz Biotechnology (2), Millipore (1), Alomone Labs (1), Abcam (1) 免疫沉淀, 免疫组化 AT1受体的抗体被发现能够对该基因缺失的小鼠组织染色。测试的不同抗体染色条带不相同,并且与AT1受体是否存在不相关。我们检测的所有商品化的AT1受体抗体均不能满足特异性的标准。 [27]
NF-κB p65抗体 6 Santa Cruz Biotechnology (4), Cell Signaling Technology (1), Chemicon (1) 免疫沉淀、免疫细胞 NF-κB p65抗体在小鼠胚胎纤维原细胞和胚胎干细胞中存在交叉反应。本文证明了许多商品化的p65抗体存在交叉反应的问题。 [28]
Muscarinic receptors antibodies 6 Alomone Labs (3), R&D (2), Chemicon (1) 免疫沉淀, 免疫组化 对MRs五个亚型的6个商品化抗体做了特异性测试。它们在免疫沉淀中均没有得到正确的条带,并且对野生型小鼠和该基因缺失小鼠的染色模式有差别。 [29]
P-糖蛋白抗体 5 Centocor Diagnstics (3), Bio/Can America (1), Media (1) ELISA、免疫组化 一些批次的P-糖蛋白单克隆抗体C219和JSB-1对A型血决定因子存在交叉反应。该研究再次强调了免疫组化中使用这些抗体的时候做充分对照的重要性。 [9]
 
表1.一些商品化抗体缺乏特异性。
抗体质量问题出现的原因及解决对策

绝大多数的抗体供应商都致力于提供高质量的抗体,然而,由于研究用抗体生产和销售相关的公司数量庞大,难免有缺乏职业道德的供应商存在。不同供应商/分销商常常采用不同的质量控制标准,有的很严格,有的根本不存在。使用这些抗体的科研人员一定要与特定的抗体供应商直接联系来发现或讨论他们的质量控制过程。更麻烦的是有的抗体供应商/分销商更改抗体的产品目录号或批号, 或单抗的克隆名。改变抗体编号,再加上有些抗体本身质量不高,造成了现在抗体市场混乱中一个最严重的问题。也就是说,如果一个抗体不合格,抗体使用者倾向于从其他供应商那里购买第二个抗体,却并不知道第二个抗体是不合格的第一个抗体改了目录号或者批号又重新销售的。一些不合格的抗体甚至能在短期内给抗体供应商/分销商提供丰厚的收益。因此,对于每一个抗体使用者来说,确保购买的第二个抗体不是改版的第一个抗体是极其必要的。

除了个别不法分子的存在以外,导致大量不合格的研究性抗体有多重的原因: 1)难以获得对特定抗原特异性的抗体,2)缺乏理想的抗体纯化方案,3)污染和储存问题,4)其他问题。

一类蛋白在种内、种间抗原和不同物种抗体中存在高度同源性,例如,前述的G蛋白关联受体。开发能够识别高度同源性蛋白的抗体难度很大。只有通过足够的质量测试才能确定这些抗体的特异性。

抗体通常通过亲和层析的方法来纯化的。该纯化方法是基于抗体和其同源的配基,或者葡萄球菌蛋白A或者G与免疫球蛋白的Fc区的可逆反应实现的 [30] 。当亲和纯化是基于蛋白A或者G(这一方法由于工艺简单成本低廉被广泛使用)来实现的时候,抗体的CDR区很可能已经与“搭车抗原(hitchhiker antigens)”的污染物结合了 [30, 31] 。这种“搭车抗原”是细胞死亡或者细胞裂解过程中产生的。“纯化”抗体中存在的“搭车抗原”导致了抗体特异性和抗体表现常常不稳定,这也被认为是影响抗体质量的一个重要因素 [10, 32] 。“搭车抗原”的存在引起人们注意,单克隆抗体下游的处理技术也应运而生 [32-34] 。一些科学家推荐采用更严格的纯化程序,例如Mechetner, L.等比较了三种去除“搭车抗原”的纯化方案:传统采用一步法、低pH洗脱缓冲液(pH 2.5)的纯化程序,和温和的用pH逐级洗脱的方法(从pH 7降低到pH 2.5)均不能有效去除“搭车抗原”;而更严格的纯化方案,在抗体固定在蛋白G上后采用四胺保护柱和高盐洗脱的方法获得了较好的效果,能够去除更多的结合组蛋白和DNA [10] 。Luhrs, K. A.等采用相似的方法用于蛋白A层析也获得了满意的结果 [35] 。这些简单的方法包括在蛋白A上加上四胺保护柱、将细胞培养上清的离子强度调节到400 mM NaCl的浓度,以及在蛋白A层析过程中采用从400 mM到2 M的梯度洗脱 [35] 。

抗体的储存和处理也可能对抗体实验结果造成影响。针对这一问题,Labome有一篇内容丰富的 讨论文章。例如储存在干冰中的抗体小瓶或者储存装置没有密闭, 或者不停晃动抗体包装可能会造成抗体退化/变性/凝集。

针对抗体质量问题,科学家推荐了多种解决策略。Parseghian推荐在ChIP实验中加入对照 [4]. Couchman, J. R.推荐做免疫组化前先用免疫沉淀方法对使用的抗体检测一下作为预警 [1]. Bordeaux, J.等推荐了一个他们实验室(the Rimm Lab Algorithm)开发的方法用于抗体鉴定 [3] 。 Alexander E. Kalyuzhny博士强调抗体使用者与供应商充分沟通的必要性 [2] 。Andrew D Chalmers等制作了一个简洁的表格用于在出版物中列出使用的抗体信息 [36]. Andrew Bradbury和Andreas Plückthun博士推荐抗体必须根据他们的序列做定义,并且将抗体制备成重组蛋白的形式 [37] 。

致谢

Las Alamos国家实验室的Andrew Bradbury博士推荐了两篇文章 [14, 15] 。

 
参考文献
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