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Western攻略:如何优化抗原和抗体的浓度

放大字体  缩小字体 发布日期:2016-12-20  浏览次数:15

每一个Western blot都涉及到抗原和抗体的相互作用,因此,抗体浓度并不是一成不变的,优化很重要。一抗和二抗浓度取决于每个抗体的特异性和抗原的特异性,以及样品中存在的抗原量。每个厂家提供的二抗特异性也不同。在改变实验参数,如更换了抗原、一抗、二抗或底物时,有必要重新优化。生物通 也许你要问,什么情况下需要优化抗原/抗体浓度呢?若Western blot出现了以下的结果,则你有必要找找原因,优化一下抗原/抗体的浓度。


• 信号弱
• 信号迅速地减弱
• 无信号,无背景
• 高背景,白色条带
• 膜上出现橙色或棕色的点
• 非特异性条带
• 弥散条带
• 斑点状背景


若是利用不同浓度的抗原或抗体,开展多次Western blot,也未尝不可,但这也太耗时了。折腾两下,一个星期就过去了。为此,赛默飞世尔旗下Pierce的专家介绍了一个简便快速的斑点印迹(dot blot)方法。简便快速的斑点印迹步骤
你要准备的材料

• 硝酸纤维素膜,剪成1 cm×8 cm的长条
• 包含抗原的样品,以PBS、TBS或类似缓冲液稀释
• 一抗和HRP结合的二抗
• 封闭液
• 洗涤液
• 底物工作液:HRP的化学发光底物(如SuperSignal底物)
• 胶片或CCD成像系统
 

操作步骤

1. 用TBS或PBS制备蛋白样品的稀释液。稀释度要取决于样品中存在的抗原浓度。由于抗原浓度通常未知,因此有必要检测宽范围的稀释度。SuperSignal底物有着皮克至飞克水平的检测灵敏度。因此样品稀释可以在微克至飞克范围。

2. 制备硝酸纤维素膜,用铅笔标上每个待测一抗/二抗的浓度。所需转印膜的数量取决于待筛查的一抗和/或二抗有多少种不同的稀释浓度。通常来说,一抗要检测一到两个稀释度,而二抗要检测两到三个稀释度。例如:使用SuperSignal底物,一抗和二抗可如下稀释:

1/1000的一抗和1/50000的二抗
1/1000的一抗和1/100000的二抗
1/5000的一抗和1/50000的二抗
1/5000的一抗和1/100000的二抗

3. 将硝酸纤维素膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。每个点的体积越少越好(1-5μl),以保证点尽可能地小。如果需要使用5μl以上的样品,在点完一次后,干燥2-5分钟,再点一次。让膜干燥10-15分钟,或直至无可见水分。

4. 用封闭液封闭膜上的非特异性位点,室温震荡孵育1 h。

5. 用包含1/10体积封闭液的洗涤液稀释一抗,并加到膜上,室温震荡孵育1h。

6. 用洗涤液洗膜4次,每次5分钟,用尽可能大体积的洗脱液。

7. 用包含1/10体积封闭液的洗涤液稀释二抗,并加到膜上,室温震荡孵育1h。

8. 用洗涤液洗膜4次,每次5分钟,用尽可能大体积的洗脱液。

9. 准备底物工作液,将等体积的SuperSignal Substrate Luminol/Enhancer溶液与过氧化物溶液混合。制备足够体积的工作液,以确保印迹点完全湿润,且印迹点在孵育过程中不会干。建议体积:0.125 ml/cm2印迹。

10. 将膜放在底物工作液中孵育5分钟。

11. 将膜取出,放在塑料布或其它防护膜上。

12. 蛋白一侧朝上,将印迹贴到胶片上,曝光30-60秒。为获得最佳结果,曝光时间可能不同。如果第一次曝光不够,再试试2-5分钟。另外,也可用CCD相机或其它成像仪。

13. 在一张优化好的印迹膜上,底物产生的信号可能会持续6-24小时,这取决于具体的产品。若结果不佳,可重新曝光。随印迹时间的延长,可能需延长曝光时间。如果仍未获得最佳结果,可用不同浓度的抗原和/或抗体重复以上步骤。

 
 
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