动态生物网
发布采购单
动态生物网QQ群
当前位置: 首页 » 技术资料 » 免疫学 » 正文

辣根过氧化物酶介绍

放大字体  缩小字体 发布日期:2015-02-16  浏览次数:34
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶,原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求:(1)来源方便,易于纯化;(2)比活性高,性质稳定;(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多个同功酶组成,分子量为40,000,等电点为PH3~9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,纯度并不表示酶活性,如当酶变性后,RZ值仍可不变。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:

                HRP
DH2+H2O2———→D+2H2O

供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。如DAB(3.3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是:OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外,还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。

由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂,因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰(说明H2O2已消耗殆尽)。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。

 
责任编辑:dsxx
 
[ 技术资料搜索 ]  [ 加入收藏 ]  [ 告诉好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 违规举报 ]  [ 关闭窗口 ]

 
0条 [查看全部]  相关评论

 
推荐图文
推荐技术资料
点击排行
动态生物网
产品检索: A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
(C)2016 动态生物网 | Processed in 1,503,120,932.495 second(s), 16 queries, Memory 0.44 M