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酸性α-醋酸酯酶检测

放大字体  缩小字体 发布日期:2015-02-14  浏览次数:56
【实验原理】 酸性α-醋酸酯酶检测(α-acid naphthyl acetate esterase assay),
是利用血细胞中的酸性α-醋酸萘酚酯酶(α-acid naphthyl acetate esterase,ANAE)在弱酸性(pH 5.8)条件下能水解基质液中的α-醋酸萘酚,产生α-萘酚,α-萘酚再与六偶氮副品红偶联形成不溶性暗红色偶氮副品红萘酚沉淀,定位于胞质内酶活性处。
【材料】
1.器材 滴管、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。
2.试剂
(1)固定液:40%甲醛溶液。
(2)0.07mol/L PBS(pH7.6):取磷酸氢二钾溶液(磷酸二氢钾0.93g溶于蒸馏水100ml中)13ml,加磷酸氢二钠溶液(磷酸氢二钠0.95g溶于蒸馏水100ml中)87ml,充分混合而成。
(3)六偶氮副品红溶液:将2mol/L HCl配制的4%副品红溶液3ml与4%亚硝酸钠溶液3ml(新鲜配置)混合。
(4)α-醋酸萘酚溶液:0.05gα-醋酸萘酚溶于50%丙酮2.5ml,4℃避光保存。
(5)温育液:将六偶氮副品红溶液3ml加入0.07mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)44.5ml中,再慢慢滴加α-醋酸萘酚溶液1.25~2.5ml,充分混匀,溶液呈淡黄色,并用1mol/L NaOH调节pH至6.0,过滤后4℃保存备用。
(6)复染液:2%甲基绿溶液。
【方法步骤】
1.新鲜涂片标本用甲醛蒸汽固定10min,流水冲洗5min,晾干。
2.将涂片置于温育液,37℃水浴箱中作用1h,水洗,晾干。
3.用2%甲基绿溶液复染5min,水洗,晾干。
4.镜检计数 用油镜观察,胞质中有棕红色或暗红色颗粒,或弥散样红色小点为阳性反应细胞。观测200个被检细胞,并计算出ANAE阳性细胞数。
【注意事项】
1.温育液配制时,各溶液需边摇边加入,滴加过快易出现沉淀,影响染色效果。一般要求当时配制,且用过一次后即不能再用。
2.标本必须新鲜。制片后要尽快固定、干燥、冲洗,以免影响酶活力。
3.染色后冲洗要快,以防止酶反应的红色产物发生消褪。
4.应先通过预实验以选择适当的复染时间,因复染时间过长、染色过深、可掩盖部分细小ANAE颗粒,影响阳性检出率。
5.结果观察 T细胞为ANAE阳性细胞,胞质内有大小不等、数量不一的紫红色颗粒或斑块;B细胞为ANAE阴性细胞,胞质呈黄绿色,胞质内无红色斑块;单核细胞为ANAE阳性,其胞质内有细小红褐色颗粒或斑块。
【参考范围】 酸性α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)主要分布在T淋巴细胞和单核细胞内;粒细胞、B淋巴细胞、红系细胞、巨核细胞和血小板中含量较少。
【临床意义】
1.有助于区分T淋巴细胞和B淋巴细胞 ANAE染色在T淋巴细胞胞质中呈现点状颗粒或大块局限阳性反应;B淋巴细胞大多数为阴性反应,偶见稀疏弥散细小颗粒。
2.辅助鉴别急性白血病类型 ①T-ALL细胞:为点状或块状阳性,局限分布。②AML细胞:大部分呈阴性或弱阳性反应,M3细胞阳性反应较强,为弥散性分布。③AML-M5细胞:大多呈强阳性反应,胞质为均匀一致的弥散样淡红色或深红色,无点状颗粒。④AML-M4:原粒细胞呈阴性至弱阳性,原始及幼稚单核细胞呈阳性。
3.辅助诊断白血病和红白血病 白血病和红白血病的异常幼红细胞可呈阳性。

 
责任编辑:dsxx
 
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