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N-碱性磷酸酯酶检测

放大字体  缩小字体 发布日期:2015-02-14  浏览次数:37

【原理】N-碱性磷酸酯酶检测(N-alkaline phosphatase assay)的原理是用P-硝基酚磷酸盐(P-NPP)作为细胞碱性磷酸酯酶(APase)总活性检测的基质,在反应中生成P-硝基酚,测量400nm时的光密度,借以检测细胞N-APase的总活性。此外,可通过巯基乙胺-S-磷酸盐(CASP)作为基质来测定N-Apase的活性。通过酶反应,生成半胱胺,用二硝基苯(DNTB)置换5-硫-硝基酚酸;测定412nm的吸光度,借以检测N-APase的总活性。在基质液中加入用N-丁醇∶水为1∶3的混合液提取的粗酶液,室温下放置60min,记录酶反应,求出酶反应的速度。一般情况下,N-APase的P-NPP与CASP的水解速度之比(VP-NPP/VCASP)在1.1~2.0的范围内,平均为1.8。因此,N-APase的活性可用VP-NPP-1.8 VCASP求出,再从(VP-NPP-1.8 VCASP)/VP-NPP计算N-APase的百分率。
 

【材料】

1.器材 试管、蒸馏设备、微量移液器、加热设备、超速离心机、721型分光光度计等。

2.试剂

(1)P-NPP。

(2)三氯化磷(PCl3)。

(3)无水氯化铝。

(4)硫磺粉末。

(5)氢氧化钠。

(6)2-氨乙基氢溴化物。

(7)N,N-二甲基甲酰胺。

(8)甲醇。

(9)乙醇。
 

【方法步骤】

1.制备巯基乙氨-S-磷酸盐(CASP)

(1) 制备三氯硫化磷(PSCl3):用蒸馏设备,加三氯化磷54.6ml,硫磺粉20.1g,加热至40~50℃,使之反应。将反应物三氯化磷用120~125℃蒸馏收集。蒸馏过程中必须注意反应物不能受潮。

(2) 制备单纯磷酸三钠:氢氧化钠40g溶于水300ml中,加三氯化磷17.5ml,用蒸馏水设备加热至110~115℃,15min以上,直到三氯硫化磷层消失为止。用冰水将其冷却,用单硫磷酸三钠与氯化钠分层,过滤后收集,溶于40~45水中,在上述溶液l00ml中,加无水甲醇185ml,使析出的单硫磷酸三钠沉淀。反复进行此项操作后,加无水甲醇 200ml,搅拌1h,使之脱水,过滤。于100℃放置1h,使之干燥,密封保存在容器中。

(3) 制备氢化巯基乙胺-S-磷酸钠:硫代磷酸三钠9.0g溶于蒸馏水50ml中,然后加2-氨乙基氢溴化物10.9g与N,N-二甲基酰胺25ml。充分搅拌40h。直至析出白色结晶,加乙醇300ml,使其在无水甲醇200ml中搅拌1h,得到结晶,在无水条件下真空干燥。
 

2.N-APase的测定

(1)粗酶液的调配:检测正常人粒细胞、淋巴细胞、白血病细胞或白血病细胞株培养的细胞时,取106~108细胞,使之在0.1mol/L Tris-盐酸溶液(pH8.0)lml中悬浮匀浆后超速离心(70000r/min,30min),保留上清液。另用n-丁醇∶蒸馏水(0.3∶1)提取小团块,亦即在有小团块的水溶液中,加n-丁醇,每5min用涡式混合器充分搅拌一次,边加丁醇边搅拌,共3次。超速离心(70000r/min,30min),取上清。用这两种上清液测定N-Apase恬性。

(2)测定N-APase活性:①用基质P-NPP测定:在含有作为基质的1.0mmol/L P- NPP的0.5mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH9.0)的基质液中,加酶液100μl,室温下进行酶反应60min。由于P-NPP水解,记录400nm吸光度的变化,从直线部分计算反应速度;②用基质CASP测定:在lmmol/L CASP,0.5mmol/L DNTB的0.5mmol/L Tris-盐酸溶液(pH9.0)的基质中,加酶液100μ1,室温下放置60min。由于酶反应,生成半胱胺,通过DNTB变换为5-硫-硝基酚酸,测定并记录412nm处的吸光度,从直线部分计算反应速度。

N-APase的活性可按前述VP-NPP-1.8VCASP计算求出百分率。
 

【注意事项】

1. CASP尚无商品出售,须自行提纯,而该方法颇为复杂,且CASP的纯度对N-APase的活性有影响。

2.因硫代磷酸三钠及正磷酸盐混入可抑制酶反应,因此制备CASP时,务必将杂质完全除去。

3.以CASP作为基质进行测定时,应在比色杯上加盖,以防止生成的半胱胺发生氧化反应。
 

【参考范围】 健康人粒细胞、淋巴细胞中不能检出N-APase的活性。
 

【临床意义】 本试验可用来检测未成熟淋巴细胞的标志。在AML及CML的慢性期、CML急粒变的原始粒细胞中,均不能检出N-APase。但在ALL和CML急淋变的原始淋巴细胞中能检出N-APase,且不仅在非T、非B-ALL的幼稚细胞,就是在T-ALL及具有B细胞标记物的原始细胞中亦可检出。因此认为此酶是从未成熟的白血病性原始淋巴细胞向T细胞、B细胞分化过程中未成熟的淋巴系统的细胞标志酶。此外,在鼻咽癌、喉癌的肿瘤细胞中,以及与EB病毒有关的传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤等,都可检出此酶。


 
责任编辑:dsxx
 
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