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末端脱氧核苷酰转移酶检测

放大字体  缩小字体 发布日期:2015-02-14  浏览次数:43
(一)酶免疫组织化学检测
【实验原理】 酶免疫组织化学检测(enzyme immunohistochemistry assay)是利用一种DNA聚合酶,即末端脱氧核糖核酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT),直接催化细胞的脱氧核苷酸,使其转移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3-OH端,合成单链DNA。兔抗牛TdT抗体能和人细胞的TdT产生交叉反应,可采用免疫荧光技术或酶标免疫细胞化学技术,用辣根过氧化物酶-抗酶复合物在细胞涂片上定位,显示细胞内的TdT。
 
【材料】
1.器材 离心管、载玻片、微量移液器、滴管、37℃水浴箱、离心机、显微镜等。
2.试剂
(1)淋巴细胞分离液(相对比密为1.077)。
(2)过氧化氢-甲醇固定液:甲醇液中含H2O2浓度为0.03%(V/V),4℃冰箱保存。
(3)0.1mol/L磷酸盐缓冲掖(pH7.2)。
(4)正常兔血清lgG。
(5)兔抗牛TdT抗体(作1:8稀释)。
(6)羊抗兔IgG(作1:10稀释)。
(7)PAP免疫复合物(作1:20稀释)。
(8)二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)溶液:0.05mol/L Tris-HCl-9g/L NaCl液(pH7.4)l00ml,含过氧化氢(V/V)0.03%,4℃冰箱保存,用前加入30mg DAB,溶解后过滤,立即避光使用。
 
【方法步骤】
1.用淋巴细胞分离液分离新鲜抗凝血,取淋巴细胞层细胞离心涂片或直接涂片、待干。
2.将涂片用过氧化氢-甲醇液于4℃固定20~30min。
3.将涂片置0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡15min。
4.滴加兔抗牛TdT抗体,置37℃湿盒内温育30min。用0.1mol/L PBS冲洗2次。
5.滴加羊抗兔lgG抗体,置37℃湿盒内温育30min。用0.1mol/L PBS冲洗2次。
6.滴加PAP免疫复合物,置37℃湿盒内温育30min。用0.lmol/L PBS冲洗2次。
7.加入DAB溶液显色,室温避光作用5~10min。水洗5min,干后镜检。也可用哈氏苏木素液复染胞核10min后再行镜检。
 
【注意事项】
1.标本必须新鲜,以保证待测抗原活性。
2.抗体、PAP复合物和封闭血液不可反复冻融,应放4℃保存。
3.一抗、二抗和PAP复合物的温育必须在湿盒内进行。加抗体和PAP复合物加样量应以足以盖过血膜为宜。在温育过程中切忌液体干涸和分布不均匀。
4.去除内源性过氧化物酶所用的H2O2浓度宜为3%~4%,浓度过高会影响细胞抗原和细胞形态的完整性。
5.若用几种抗体同时检测不同的抗原,在第一抗体温育和漂洗过程中,要避免交叉污染。
6.双PAP法的重复标记可提高对微弱抗原的检出率,但以重复2次为宜,否则会增加非特异性着色和背景污染。
 
【判断结果】 阳性反应为棕黄色颗粒,定位在细胞核上。TdT为早期T淋巴细胞的标志,在正常情况下不成熟的胸腺淋巴细胞出现阳性反应。
 
【临床意义】 95%以上ALL和大约30%慢粒急淋变患者外周血细胞呈阳性反应,病情缓解后阳性率逐渐减弱。在ALL中,由于细胞表面标志不同,TdT活性也有变化,T-ALL,non-T-ALL,non-B-ALL细胞的阳性率很高。B-ALL细胞阴性。当外周血中此酶活性升高,预示血细胞的恶性变。因此TdT的测定对急性白血病的鉴别和治疗监测有一定意义。
 
(二)放射性同位素检测
【实验原理】 以3H或14C标记的脱氧腺苷三磷酸等的dXTP为基质,用低聚脱氧核苷(dA)等人工同聚物作为引物,由于酶反应与引物重合,使基质不溶于三氯醋酸,可用玻璃纤维盘将其吸附,从未被放射性同位素标记的反应基质中分离出反应的生成物,并测定其放射活性。扣除不加引物所测定的内源性反应所引起的放射活性之后,可测算酶的活性。
 
【材料】
1.器材 试管、微量移液器、超速离心机、超声波细胞破碎机、液体闪烁
计数器等。
2.试剂
(1)淋巴细胞分离液(相对比密为1.077)。
(2)3H或14C标记的脱氧腺苷三磷酸等。
(3)脱氧腺苷三磷酸。
(4)多聚脱氧腺苷或低聚脱氧核苷(dA)。
(5)二硫苏糖醇(DTT)。
(6)苯甲基磺酰氟化物(PMSF)。
(7)TritonX-HCl(pH7.5)。
(8)Whatman GF/C玻璃纤维盘。
(9)吡咯啉酸。
(10)乙醇。
(11)乙醚。
(12)甲苯系列闪烁液。
(13)蔗糖-TKM缓冲液:250mmol/L蔗糖,50mmol/L三氯醋酸(TCA)pH7.4,25mmol/L氯化钾,5mmol/L氯化镁,5mmol/L DTT,lmmol/L PMSF,5ml/L TritonX-100。
 
【方法步骤】
1.用蔗糖-TKM缓冲液提取末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),用d(PA)12~18测定TdT活性。
(1)提取粗酶液:在蔗糖-TKM中,加入经淋巴细胞分离液分离的白血病细胞(末梢血或骨髓血),使成1×1011个细胞/L的悬液,放在干冰-丙酮中,使之急剧冻融5次,将细胞破坏,或用安装有微尖型探针的超声波细胞破碎机,使细胞破坏后,在冰浴中振荡15min,提取TdT,超速离心(70000r/min,60min)。取上清液作为粗酶液。
(2)测定TdT活性:取粗酶液50μl与测定TdT的基质液[50mmoI/L Tris-HCl pH7.5,30mmol/L氯化钾,0.5mmol/L DTT,5mmol/L dGTP (含有poly DT 0.05U,3H-dGTP37kBq)各50μl]混合,37℃温育20min后,置冰浴中使反应停止。将一部分涂在 Whatman GF/C玻璃纤维盘上。立即将此盘放入冰冷的60mmoI/L TCA+0.05mol/L吡咯啉酸液中,振荡15min,洗盘,再用30mmol/L TCA+0.025mol/L吡咯啉酸,冲洗2次,分别用乙醇及乙醚洗净,使盘干燥。把干燥的盘放入液体闪烁计数器用的小玻瓶中,加甲苯系列的闪烁液,使吸附在玻璃纤维盘上的反应生成物具有放射活性,再用液体闪烁计数器测定[通常以mmol dGTP掺入1×108个细胞来表示TdT活性,或用U/1×108细胞表示(1U等于60min内有lnmol的dGTP)]。
2.用0.25mol/L磷酸钾(pH7.5)提取TdT,用d(PA)40~60测定TdT活性,用含 lmmol/L 2-巯基乙醇(2-ME)的0.25mol/L磷酸缓冲液(pH7.5),在缓冲液中细胞以1×1011/L左右的浓度悬浮,用超声波破坏细胞(4次/15秒),将其超速离心(70000r/min,60min),所得上清液即是测定TdT活性的粗酶液。

【注意事项】
1.当测定ALL的幼稚细胞等有极高活性的标本时,即使使用粗酶液也能满意地检出其活性。当测定TdT活性低的标本时,由于在粗酶液中包含有蛋白酶,可能对TdT产生影响。此外,核酸酶的引物、反应生成物及某些抑制物及内源性引物等,均可能影响检测结果。用磷酸纤维素柱及蔗糖密度梯度离心沉淀法沉淀,用部分酶提纯进行测定时,可使这些问题在某种程度上得到解决。
2.为了从细胞中充分提取TdT,必须使用0.25mol/L的磷酸钾缓冲液,因为高浓度的盐可抑制TdT的活性。测定时应将提取液稀释5倍以上。为使粗酶液的盐浓度下降而进行透析时,会导致TdT失活。
3.本试验使用放射性试剂,试验的整个过程应避免放射性污染。
 
【参考范围】 健康人骨髓细胞的活性为dGTP掺入1×108个细胞的量为0~0.09mmol/L。
 
【临床意义】
1.ALL(T、B、非B型)可检出较高的TdT活性,CML急性变时,约有1/3的病例在原始细胞中能检出高的TdT活性。
2.恶性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤的淋巴结细胞中可检出较高的TdT活性。
3.TdT检测在研究造血细胞的分化与白血病的关系、白血病细胞的起源、白血病的治疗药物选择上都有重要的价值。
 
责任编辑:dsxx
 
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