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硝基四氮唑蓝还原试验

放大字体  缩小字体 发布日期:2015-02-14  浏览次数:32
【实验原理】 硝基四氮唑蓝还原试验(nitroblue tetrazolium reduction test),是观察中性粒细胞对硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium,NBT)还原作用的试验。NBT是一种染料,其水溶液呈淡黄色。当被吞入或渗入中性粒细胞后,有产生过氧化物酶的作用,并可接受己糖旁路代谢途径中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作用产生的NADPH氧化脱下的氢,而被还原成非水溶性的蓝黑色甲月替(formazan)颗粒,并呈点状或斑块状颗粒沉淀于胞质内有酶活性的部位,可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比,借此反映中性粒细胞的杀菌功能。
【材料】
1.器材 小试管、滴管、载玻片、水浴箱、显微镜等。
2.试剂
(1)0.15mol/L pH7.2磷酸缓冲葡萄糖生理盐水(PBGS):取0.15mol/L Na2HPO4溶液7.6ml,0.15mol/L KH2PO4溶液2.4ml及0.15mol/L NaCl 10ml,混匀,加20mg葡萄糖,溶后过滤分装,8磅高压蒸汽灭菌20min,4℃保存。
(2)NBT试剂:取NBT l0mg,加入生理盐水5ml。室温振摇1h溶解(NBT难溶,亦可置80℃水浴中摇动或搅拌助溶),滤去少数不溶性颗粒后,小量分装,此即贮存液,4℃可保存3~6个月。用时取需要量与等量PBGS混匀即为NBT试剂。
(3)肝素溶液:无防腐剂肝素注射液,用生理盐水稀释成1.25×105U/L。
(4)10g/L沙黄(safranin)水溶液:取沙黄1g,先加l~2ml 95%乙醇助溶,然后边振荡边加蒸馏水使之溶解成l00ml。滤纸过滤后,室温避光保存。
(5)甲醇等。
【方法步骤】
1.取一小试管,加肝素溶液0.05ml,再加受检者外周静脉血0.5ml,混匀。
2.取抗凝血0.1ml与等量NBT试剂在小试管内混匀,盖住管口。置37℃温育25min,中间振摇1次,再置室温15min。
3.轻轻摇匀细胞,用滴管吸出1滴于载玻片上,推成涂片,立即吹干。甲醇固定2~3min,吹干。10g/L沙黄水溶液染色5min,水冲洗,待干。
4.镜检计数 油镜下观察,凡中性粒细胞胞质内含有点状或斑块状深蓝色甲月替颗粒沉着者(只见一个典型颗粒也算),即为NBT阳性细胞。计数100~200个中性粒细胞,算出NBT还原阳性细胞百分率。
【注意事项】
1.所用器材要清洁,避免玻璃表面因素增加NBT还原作用。
2.NBT试剂需用超细玻璃器过滤,不要残留颗粒;注意保存,不要被细菌污染。
3.孵育方式不同,会影响检出结果,在水浴内孵育的NBT还原阳性率会比在普通温箱中孵育者高。
4.涂片要推出头、体、尾,并厚薄适宜。太厚影响观察;太薄则细胞难找,计数费时。
5.单核细胞也可能还原NBT,应注意。聚集的或己破损的中性粒细胞,不可计数在内。
6.常有血小板粘附在中性粒细胞上,易与甲月替颗粒混淆,应仔细区别。
7.如无沙黄,也可用50g/L甲基绿染色15min代替;也可用瑞-吉染色,但切忌染液干涸在载玻片上。
【参考范围】 正常成人的NBT阳性细胞数在10%以下。若有10%以上中性粒细胞能还原NBT,即为NBT还原试验阳性;低于10%则为阴性。
【临床意义】 一般认为中性粒细胞在吞噬杀菌过程中,能量消耗骤增,己糖磷酸旁路代谢活性增强,还原NBT形成甲月替的能力也随之增强。故此试验可用于定性检测中性粒细胞产生O¯2的能力,以间接判断中性粒细胞的杀菌能力。
1.用于中性粒细胞吞噬杀菌功能异常的筛选和辅助诊断 NBT还原试验阴性见于儿童慢性肉芽肿(CGD)、G-6-PD缺乏症、家族性X染色体连锁致死性肉芽肿(FFG)、髓过氧化物酶缺乏症和Job氏综合征(高IgE、IgA)时。如在涂片中能查出几个出现甲月替沉淀的中性粒细胞即可排除CGD。如在涂片中未查出有甲沉月替淀的中性粒细胞,即为可疑CGD时,可作细菌内毒素激发试验确诊之。方法如下:将1g大肠杆菌内毒素溶于5ml生理盐水,取0.05ml与0.5ml肝素抗凝血(12.5U肝素/m1血)在试管内混匀,盖住管口置室温15min后,按前述方法进行NBT还原试验.若NBT还原阳性细胞超过29%,即可否定CGD;若仍在l0%以下,即可诊断为中性粒细胞吞噬杀菌功能异常。
2.鉴别细菌感染和病毒感染 细菌感染时,中性粒细胞数量增多,粒细胞糖分解代谢活性增强,因此,全身性细菌感染时,患者的NBT还原阳性细胞通常在10%以上,而病毒感染或其他原因发热的患者则在10%以下。但若细菌感染而无内毒素等激发白细胞还原NBT的物质入血时,也可在10%以下。而病毒感染时常不增加或相对降低。
3.器官移植后发热的鉴别 器官移植后发热,若非细菌感染所致,其NBT还原试验阴性;若该试验阳性,则提示可能有细菌感染。
4.无丙种球蛋白血症、镰状细胞病、恶性营养不良、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病等,以及应用激素、细胞毒药物、保泰松等治疗时,NBT还原阳性细胞比例可降低。
5.新生儿、小儿成骨不全症、心肌梗死急性期,淋巴肉瘤,变应性血管炎、脓疮性银屑病、皮肌炎、某些寄生虫感染(如疟疾)、全身性真菌感染(如白色念珠菌性败血症)、注射伤寒菌苗后、口服避孕药或孕酮后,NBT还原阳性细胞比例可增高。
 
责任编辑:dsxx
 
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