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PCR方法实验步骤和常见问题

放大字体  缩小字体 发布日期:2015-01-06  浏览次数:101
简介

聚合酶链式反应,简称PCR,是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法,这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域,几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变,在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。而人类基因组计划,这一具有划时代意义的测序工程,如果缺少了PCR技术手段则根本无法开始。

而PCR技术的发明同样有着一个传奇的故事。PCR技术的发明者Kary Banks Mullis讲述过他是如何捕捉到PCR的灵感的:1983年春天的一个晚上,他开着车行驶于加利福尼亚的群山公路之中,那蜿蜒的公路让他瞬间想到了PCR扩增的机制。之后他便不断的实验,最终取得了成功。而PCR技术的成功也让他获得了1993年的诺贝尔奖金。

PCR技术的原理相当简单,只要你明白体内DNA复制的机制便能轻松的理解。我们只是简化了体内的过程并让反应在PCR管中进行。我们知道DNA复制需要DNA模板,短的引物,聚合酶,dNTP以及聚合酶发挥活性的环境,我们优化得到适合DNA聚合酶反应的缓冲液并顺序加入dNTP,特异性的引物以及模板之后便能开始PCR。如果想要提高聚合酶的特异性,你可以尝试各种来源的DNA聚合酶或进行改造。

要开始PCR反应,首先需要将DNA模板进行变性来释放出单链的DNA,这通常需要94或98度的高温;之后将温度降低到50-65度让特异性的引物与单链DNA模板形结合,这一步称之为退火,退火温度取决于引物的特性如长度以及GC碱基的含量。退火之后需要将温度调整到适合DNA延伸的温度,这取决于你选用的DNA聚合酶:不同的DNA聚合酶有着不同的最适温度。当上述的过程完成便称为一个循环。通常PCR反应包含有20-40个循环,这样理论上你可以得到220-40 的DNA拷贝数。

试剂

DNA模板,与特定DNA模板结合的引物,去离子水,商业化的DNA聚合酶以及缓冲液,dNTP, MgSO4(可选)和DMSO(可选)

步骤

假设我们已经有了各种试剂和PCR仪,那我们便可以开始PCR实验:将各种试剂混合并按照说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下:
1.起始步骤:这对于热启动PCR而言是必须的,将反应混合液加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这一步的时间取决于所选用的DNA聚合酶。
2.变性步骤:DNA本身是双链结构,而DNA扩增需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步,反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。
3.退火步骤:变性之后,DNA模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与DNA模板互补,当反应温度降至50-65度时,引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的Tm值,通常比引物Tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒,而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
4.延伸步骤:在这一步,DNA聚合酶开始DNA合成,因此这一步的温度选取的是DNA聚合酶的最优温度。通常我们选用72度,但某些DNA聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的DNA复制很相似:DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。
5.第2步至第4步称为一个循环:每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍。通常一次PCR反应进行30-35个循环。在前几轮的PCR循环过程中PCR产物的量以指数速率增长,但是到了反应后期随着dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活,反应速率逐渐下降,因此PCR反应的产量也受到了限制。
6.最后的延伸步骤:当30-35个循环结束后,我们通常会以68-74度延伸5-10分钟,这是希望使反应体系中残留的单链DNA全部反应完毕。
7.维持时间:通常我们设置4-10度为反应后PCR产物的保存温度。

PCR反应开始前的准备工作

PCR反应开始前,你需要准备好DNA模板(基因组DNA或者反转录制备的cDNA),特异性的引物(手动设计或利用软件设计)并选择合适的商业化DNA聚合酶(根据实验的目的不同做出决定)。
1.DNA聚合酶的选择。市面上有多种DNA聚合酶可供选择,他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将DNA聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的PCR产物,那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否,那普通的Taq聚合酶已经足够。另外要注意的一点是,进行T载体连接的时候,要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的,因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶。
2.引物。引物特异性会影响到PCR反应成功的可能性,好的引物设计对PCR成功至关重要。设计引物时,有以下几条原则需要谨慎考虑:1.引物长度。通常PCR引物长度在18-22个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。
2.解链温度Tm。Tm值的定义是使得一半双链DNA解螺旋成为单链DNA的温度。引物的Tm值通常要在52-58度之间。
3.GC含量。最适合的GC含量为40-60%。
就目前而言很多软件都可以用来设计引物,如primer5和Oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。

问题解答
一.无条带
1.反应体系错误。重新配置反应体系确保各种试剂加入的量没有问题。
2.PCR程序出错。检测PCR仪程序是否正确。
3.DNA胶问题。DNA凝胶电泳时加入阳性对照。
4.退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
5.DNA模板量太少。增加DNA模板量。
6.引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
7.DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
8.模板有复杂结构。加入DMSO,BSA或者甜菜碱。可尝试递减PCR。

二.PCR产物量过少
1.退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
2.DNA模板量太少。增加DNA模板量。
3.PCR循环数不足。增加反应循环数。
4.引物量不足。增加体系中引物含量。
5.延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
6.变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
7.DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

三.有杂带
1.复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
2.引物退火温度过低。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
3.反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
4.引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
5.引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
6.模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
7.外源DNA污染。确保操作的洁净。

四.条带弥散
1.复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
2.模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
3.酶量过多。减少DNA聚合酶的使用量。
4.循环数过多。减少反应循环数至30.
5.引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
6.引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

五.阴性对照出现条带
1.试剂,枪头,工作台污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。

六.条带大小与理论不符
1.污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。
2.模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3.基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。
 
 
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