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全自动化的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织标本提取技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2015-01-06  来源:来邦网  作者:译者 王秀英  浏览次数:173
摘要

西门子开发了全自动的核酸纯化方法,其支持分子病理学实验室常规的临床诊断分析,为广泛的长期临床随访资料保存下来的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织材料中生物标志物的回顾性研究铺平了道路。
这种全自动化提取系统的主要特点是:
独特的磁性颗粒技术(磁珠大小<1微米),使用了二氧化硅纳米涂层
在不到4小时中高通量处理FFPE样品多达48个
从FFPE样本中联合提取RNA和DNA(消化步骤可选择自动DNA酶)
通过疏水吸收可以完全集合去石蜡化步骤(二甲苯/乙醇步骤)


英文摘要

Siemens has developed a fully-automated nucleic acid purification method which supports routine clinical diagnostic analysis in the molecular pathology laboratory as well as paves the way for extensive retrospective biomarker studies of archived formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue material with long-term clinical follow-up data.
The key features of this fully-automated walk-away extraction system are:
Unique magnetic particle technology (bead size < 1 μm) coated with a nanolayer of silica
High throughput of up to 48 FFPE samples in less than 4 hours
Co-extraction of RNA and DNA from one FFPE sample (with optional automated DNase I digestion step)
Fully-integrated de-paraffinization by hydrophobic absorption (ny xylene/ethanol steps)


内容

鉴别和验证福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中的分子标记物是目前研究活动的热点区域。这部分是因为基于表达分析、基因分型和基因突变分析已经被证明可以帮助诊断并提供指导的这一事实,特别是在癌症治疗方面。尽管经过集体努力,迄今为止,只有有限几个使用从组织病理学标本中提取的核酸的标记物或标记引物被引入日常临床实验(例如OncotypeDX;基于靶向治疗的表皮生长因子受体的K-ras基因的突变分析)。FFPE组织是一种研究基于DNA、RNA和微小RNA的生物标志物转换过程的宝贵工具,因为FFPE组织是很容易应用于常规的临床诊断。硬件设施及临床和随访资料库相关的各种疾病实体的FFPE组织的存取都非常便利,这使得它特别有吸引力。

免疫组织化学(免疫组化)检测病理标本中的蛋白表达是公认的检测方法,也是目前诊断程序的一部分。与此相反,用DNA特别是从FFPE组织中提取的mRNA来进行分析仍然比较困难,因为固定过程需要使蛋白质与核酸交联。这种交联可以对大量的分子和核酸片段进行化学修饰。此外,有许多介绍从FFPE组织中提取核酸的方法,尤其是那些高度说教的不规范的实验指南(例如,可变的裂解时间和不同的化学物质用于RNA和DNA提取)。此外,这些指南所述的操作流程不仅耗时且要求在去石蜡化时使用危险和易燃的材料如二甲苯和乙醇。以上这些因素都要求创建标准化操作流程以适应个性化的需求。因此,这些单个的操作流程已不能满足高通量的要求。

伴随着西门子对全自动化分子病理学和伴侣诊断测试方法的开发,无论是在常规临床诊断还是科学研究中,从FFPE组织样本中分离核酸的困难都得以解决。

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图 1. 西门子纳米二氧化硅涂层的磁性氧化铁珠粒(左)与其他厂家典型的二氧化硅磁性珠粒(右)电子显微镜照片等厂家磁性的比较。 注意图片的不同尺寸。

这项技术的基础是由西门子开发的专有的硅涂层顺磁性粒子(PMP)。这些顺磁性粒子是采用一种简单而强大的生产制造程序而制成的,由于粒子的某些优越性质,特别是吸附在颗粒上的硅纳米涂层,简化和改进了核酸的自动化分离。图1显示了西门子公司的PMP相对于其他商用珠的比较结果。在离液条件下(正选)核酸选择性的结合;但是,“杂质或组织碎片”在非离液不含目标物(阴性选择,见下文)的条件下也可结合。粒子可以达到最佳悬浮行为是由于其体积非常小,粒度分布的均匀以及强磁化特性。一种通用的化学裂解萃取,洗涤和洗脱步骤已经被开发出来,可以有效地从广泛的标本类型(如图2所示)中同时提取DNA和RNA并达到较高的回收率和纯度。

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图 2. 西门子全自动化的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织标本提取技术工作流程图。包括两条自动化的石蜡和组织碎片清除负选择步骤。 请注意,自动酶消化步骤是可选的。

西门子FFPE组织提取方法的一个主要优势是工作流,它将去石蜡化步骤整合到提取过程中,使得整个处理过程实现全自动化。去石蜡化是在裂解过程中通过一种简单而有效的熔融石蜡疏水吸收至聚丙烯样品管的内管壁上而实现的。这一步不仅替换了有毒和困难的二甲苯/乙醇的处理步骤,而且不需要离心。因此,西门子的处理过程更能称得上是名副其实的全自动化。它还允许FFPE切片在切片机切片后立即负载。

而“固体”FFPE样本,由于细胞/基质组成、固定和储存条件可能有天壤之别,所以组织提取难以标准化。因此,许多其他方法需要通过改变孵育时间以实现完全裂解。西门子技术的另一个主要特点是PMP的功能。在没有离液盐的情况下,结合并消除任何未消化的组织(碎片)(称为负选择)。这种负选择是有效和完整的自动化过程的关键要素。因为任何不溶性物质都会干扰液体处理的准确度和造成吸头堵塞。

西门子平台使用专门的硬件用于将FFPE切片在1.5毫升的塑料管中放置和裂解,并且塑料管会直接负载于系统上。该系统可以在不到4个小时内达到48个样品的吞吐量,并且包括一个30分钟的用于使纯化的RNA分离的DNaseI消化孵育过程(在3小时15分钟内只有8个样本被处理)。如果DNA是目标物,对48个样品的总处理时间缩短为2小时40分钟,因为DNaseI步骤不是必需的。通用的用于提纯的化学试剂可以分离同一个标本里面的DNA和RNA。一个简单的软件查询应用于自动的DNaseI消化步骤以达到精确表达分析。在典型的DNA应用中,诸如突变及经典或超深序列多态性分析,总核酸包括洗脱液都可以适用。

全自动提取可以处理各种样式的样品包括标准的FFPE切片,微小组织如组织微阵列(TMA)内核,以及穿刺活检中的固定区域。即使是激光捕获微切割的细胞、快速冰冻的组织和培养的细胞都可用于提取。

除了具有完全自动化的高吞吐量工作流的优势,该方法还可以回收大量的高纯度RNA与DNA。从几千个年龄大于30岁的人的FFPE样本中提取PCR法可检测到的RNA或DNA的成功率约为99% [1][2][3][4]。从一个组织切片中获得的标准的100微升洗脱液通常可以成功运行上百个PCR反应。

总的来说,与其他制造商现有的提取方法相比,西门子全自动核酸提取方法拥有许多优势。全自动化的主要优点包括集成的无二甲苯的去石蜡化步骤,在不到4个小时内处理多达48个样品的高样品通量,一个稳定和普遍的用于DNA和RNA共分离的化学提取试剂,一个标准化的一小时裂解时间,一个阴性组织结合/选择步骤可以避免离心,根据组织类型和样式可灵活的加载样品,优越的切片到切片的重现性,减少交叉污染的风险,具有与后续检测技术如动力学(逆转录)聚合酶链反应、端点聚合酶链反应、测序和芯片等的兼容性。西门子核酸纯化方法为广泛的归档保存的在长期临床随访资料中获取的FFPE材料中生物标志物的回顾性研究铺平了道路。此外更重要的是,它支持在临床或分子病理实验室对这种材料的常规分析。


参考文献
1. Bohmann K, Hennig G, Rogel U, Poremba C, Mueller B, Fritz P, et al. RNA extraction from archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue: a comparison of manual, semiautomated, and fully automated purification methods. Clin Chem. 2009;55:1719-27 pubmed

2. Petry C, Gehrmann M, von Törne C, Weber K, Stropp U, Hennig G. [Predictive and prognostic markers of breast cancer. Molecular biological analysis of fixed tumor tissue]. Pathologe. 2008;29:181-3 pubmed publisher

3. Hennig G, Gehrmann M, Stropp U, Brauch H, Fritz P, Eichelbaum M, et al. Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression. Clin Chem. 2010;56:1845-53 pubmed publisher

4. Müller B, Kronenwett R, Hennig G, Euting H, Weber K, Bohmann K, et al. Quantitative determination of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 mRNA in formalin-fixed paraffin-embedded tissue--a new option for predictive biomarker assessment in breast cancer. Diagn Mol Pathol. 2011;20:1-10 pubmed publisher
 
 
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