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应用A 蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

放大字体  缩小字体 发布日期:2014-11-26  来源:生物技术通报  作者:周华蕾 吕茂民 王娜 刘子 章金刚  浏览次数:139
摘 要:  应用Protein A 亲和层析法,从采集的小鼠腹水中纯化出了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体,用SDS-PAGE 和EL ISA 法分别检测了纯化后单克隆抗体的纯度及效价,结果显示,电泳为两条带,分别为免疫球蛋白G( IgG) 的重链和轻链,纯化后的单克隆抗体纯度达到电泳纯,应用间接ELISA 法测定腹水效价为1 ×10-7 左右,与未纯化前无差异。结果表明,应用A 蛋白亲和层析法能够得到纯度较高的单克隆抗体,适用于高纯度单克隆抗体的制备。

The antibodies agaist human blood clotting factor Ⅶwere purified by using affinity chromatography with protein A sepharose CL-4B. The titers and purity of the purified monoclonal anti-F Ⅶwere determined by indi-rect EL ISA and SDS-PAGE respectively. The result of SDS-PAGE had reached the srandard of elect rophoretic purity. The titers of the purified antibody in ascetic fluid were about 1 10-7 by indirect EL ISA. The result s indicated that the antibodies of higher purity had been prepared by using protein A affinity chromatography , which were fit for the preparation highly purified monoclonal antibodies.

关键词:  A 蛋白 纯化 单克隆抗体


A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上清中的单克隆抗体(简称单抗) 。

本课题组制备了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体的细胞株,并诱生腹水。抗体的免疫球蛋白类别为IgG,亚类为IgG2a 。作者用Protein A2Sep harose CL-4B 亲和层析柱分离纯化了腹水。并对纯化后的单克隆抗体进行鉴定。结果表明,用Protein A-Sep harose CL-4B 亲和层析柱分离提纯IgG,方法简便快捷,分离后的IgG纯度高,特异性强,便于后续工作的进行。

1  材料与方法
1. 1  主要试剂及仪器
抗体为分泌抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体的细胞株诱生的腹水,由本室制备。Protein A-Sep harose CL-4B及Sigma 3 K18 离心机为美国SIGMA 公司的产品。A KTA explorer100 为瑞典Pharmacia 公司产品。高压电泳仪为江苏丹阳无线电一厂产品。其余试剂及材料为国产。
1. 2  方法
应用Protein A - Sepharose CL-4B 亲和层析法纯化单克隆抗体,A KTA explorer100 进行监测。
1. 2. 1  腹水的处理 取腹水,在4 ℃,12 000g 条件下离心15min ,以除去较大的凝块。
1. 2. 2  装柱 将1.5g Protein A-Sep harose CL-4B 干粉用6~7ml 三蒸水溶解,再用0.02M ,pH7.4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液) 浸泡15min ,然后装入层析柱中。
1. 2. 3  平衡 用10 倍柱床体积的上样缓冲液过柱,流速为1ml/ min , p H 试纸测试流出液体的pH 为7.4 。
1. 2. 4  上样 取预处理过的腹水5ml ,用上样缓冲液稀释至50ml ,用0. 45μm 的滤膜过滤,上样,流速为1ml/ min 。
1. 2. 5  洗脱 用上样缓冲液进行流洗,10 倍柱床体积,流速为1ml/ min 。随后用0. 02M ,pH4.0 的柠檬酸缓冲液洗脱抗体,同时应用A KTA explorer100 进行监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时,取干净的4ml 离心管收集,每收集3ml 后,立即用1M ,pH9.0 的TRis-Hcl 缓冲液调整p H 值至7.0 。
1. 2. 6  平衡 收集洗脱液至洗脱峰回到基线后,继续用上样缓冲液平衡5~10 倍柱床体积,流速调至1ml/min 。再用三蒸水平衡10 倍柱床体积。
1. 3  电泳鉴定
采用SDS 不连续丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) ,浓缩胶和分离胶浓度分别为120g/ L 和50g/ L ,每槽加样10μl ,考马斯亮蓝R250 染色。具体操作见参考文献[1 ] 。
1. 4  活性检测
应用间接EL ISA 法测定效价。

2  结果
2. 1  Protein A-Sep harose CL-4B 柱层析
应用A KTA explorer100 监测分离纯化色谱图(图1) ,上样时所监测到穿透峰的280nm 波长OD 值为800AU 左右,洗脱时得到一个洗脱峰,此峰最大的280nm 波长OD 值为3 300AU ,此值远远大于穿透峰值。



图1  Protein A-Sepharo se CL-4B 层析图
横坐标:时间(min)  
纵坐标:280nm 波长OD值(mAU)  
峰1 :穿透峰; 峰2 :洗脱峰


2. 2  SDS-PAGE 鉴定结果
5 倍稀释腹水的SDS-PAGE 结果为多条带,纯化后的IgG只有两条带,上下两条带分别为IgG2a的重链及轻链(图2) ,分子量分别是50kDa 、26kDa ,与理论值相符合。


图2  纯化IgG的SDS2PAGE 鉴定结果
a :标准蛋白marker  b :纯化的IgG2a ,上下两条带分别为免疫球蛋白( IgG2a )的重链及轻链c :5 倍稀释腹水的条带


2. 3  纯化后的免疫活性
应用间接EL ISA 法,检测纯化前腹水的效价为1 ×10- 6 ~1 ×10- 7 ,纯化后的效价仍维持在1 ×10- 7 左右。
3  讨论
1975 年, Kohler 与Mil stein 成功地建立了单克隆抗体的制备技术。近年来,单克隆抗体技术已成为生命科学研究的重要手段,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面具有不可或缺的作用。由小鼠杂交瘤所分泌的单克隆抗体类型与小鼠血清的免疫球蛋白相同,常见的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白类型是IgG、IgA、IgM ,其中IgG包括IgG1 、IgG2a 、IgG2b 及IgG3 4 个亚类。腹水中除了单克隆抗体成分外,还含有大量杂蛋白。在大多数情况下,为了满足单克隆抗体在科学研究领域中的需
要,对细胞培养上清或腹水中的单克隆抗体需进行纯化。纯化单克隆抗体的方法多种多样,主要有以下几种:1) 盐析法,如硫酸铵盐析法[2 ] 、辛酸-硫酸铵盐析法[2 ] ;2) 离子交换层析,如羟基磷灰石层析[ 3 ] ;3) 亲和层析:如A 蛋白亲和层析、G蛋白亲和层析、免疫亲和层析;4) 凝胶过滤;5) 疏水层析;6) 高压液相层析等[ 4 ] 。

Protein A-Sepharose CL-4B 亲和层析法的原理是,A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地结合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合力,结合的强弱程度依次是: IgG2a > IgG2b > IgG3 > IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p H 依赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯化与其结合较弱的IgG1[5 ] 。这种亲和层析法适用范围很广,可用于抗体的分离纯化,实现一步法纯化单克隆抗体,所得到的抗体纯度很高。此外,还可应用于:1) 除去抗体液中的IgG,进行非IgG类免疫球蛋白(如IgM) 的相关研究[6 ] ;2) 除去胃蛋白酶或木瓜蛋白酶水解的IgG 的Fc 段[7 ] ;3) 回收或纯化免疫复合物。A 蛋白亲和层析技术具有很多优点: 1) 可以纯化小鼠IgG的4 个亚类,在一定条件下,可以纯化人的IgG;2) 实验操作方便快捷,易于自动化连续工作,可以少量制备,也可以大规模生产;3) 纯化后的单克隆抗体产率高,特异性强;4) A 蛋白具有良好的再生性,其耐受低p H 反复处理的性能极佳,可反复使用。若长期不用,则应保存于叠氮钠或20 %的乙醇中,4 ℃存放。此项技术的主要缺点是该介质的价格昂贵。本课题组制备的抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体的免疫球蛋白类别为IgG,亚类为IgG2a 。适合采用Protein A-Sep harose CL-4B 亲和层析作为分离纯化抗体的方法。实验过程中应用p H 7. 4 的缓冲液,使IgG2a与A 蛋白结合,应用p H 4. 0的柠檬酸缓冲液进行洗脱。实验结果显示,用Protein A-Sep harose CL-4B 亲和层析柱分离提纯IgG,方法简便快捷,分
离后的IgG纯度高,特异性强,并为后续工作的进行奠定了良好的基础。需要注意的问题是,在酸性条件下洗脱的抗体必需立即中和到中性(p H 7. 0 左右) ,以利于维持抗体的生物学活性,避免抗体失活。

   应用A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体.pdf
 
责任编辑:dsxx
 
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