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HRP标记抗体之简易过碘酸钠法

放大字体  缩小字体 发布日期:2014-10-16  作者:优尔生  浏览次数:123
本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。
 
1. 原理
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
 
2. 试剂及器材
(1)0.1M NaIO4:称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂,批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml;0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml;加蒸馏水至2,000ml。
(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:Na2CO3 0.32g;NaHCO3 0.586g;加蒸馏水至50ml,再用蒸馏水作20倍稀释,即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
(4)NaBH4溶液(4mg/ml):临用时称取NaBH4 4mg溶于1ml蒸馏水中。
(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。

3. 标记步骤
(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中,对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜。
(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5,然后立即加入10mg IgG(抗体,或SPA 5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃ 2小时。
(6)将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS透析,4℃过夜。
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃ 1小时。
(8)3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(9)将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。

4. 结果判定
除标记物IgG量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。
IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
 
 
责任编辑:dsxx
 
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