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质粒DNA的提取和纯化\BAC文库构建筛选 -百博明创

   日期:2014-09-03     来源:百博明创    作者:百博明创    浏览:149    评论:0    
核心提示:质粒DNA是细菌细胞中小的共价闭合环状双链DNA。由于基因工程中使用的载体主要是质粒,因此,质粒DNA的提取和纯化是进行基因工程的重要前提。
  质粒DNA的提取和纯化

1 质粒DNA的提取
质粒DNA是细菌细胞中小的共价闭合环状双链DNA。由于基因工程中使用的载体主要是质粒,因此,质粒DNA的提取和纯化是进行基因工程的重要前提。提取质粒DNA的方法很多,下面介绍几种有代表性的程序。
1)酚提取法 
2)碱提取法 其基本原理是在溶菌酶和SDS破壁释放DNA后,在强碱条件下,DNA变性成单链,当加醋酸钠(NaAc)适当中和pH时,质粒DNA复性;而Ch-DNA和大分子RNA仍为单链并与蛋白质-SDS复合物被高盐沉淀,质粒DNA留在溶液中。不需经酚氯仿抽提,即可直接用乙醇沉淀上请中的p-DNA)。
3)煮沸提取法 此法快速简便,既可小规模检验也可大规模制备质粒DNA。其基本原理是在溶菌酶和Triton破壁释放DNA后,迅速煮沸,使Ch-DNA和蛋白质沉淀,质粒DNA留在溶液中。
2 质粒DNA的纯化(PCR产物的纯化)
(1)加入0.1倍体积的10×STE缓冲液
⑵ 加入等体积的4 mol/L NH4Ac
⑶ 加入2.5倍体积室温放置的无水乙醇
⑷ 立即在室温下12 000r/min, 离心10 min,使DNA沉淀,小心地去掉上清
⑸ 加入200μl的70%(V/V)乙醇
⑹ 室温下12 000r/min, 离心10 min,小心地去掉上清,干燥
⑺ 用与原样品体积相等(或减小体积以使样品浓缩)的TE缓冲液重悬DNA,放置4℃待用, 或-20℃贮存。
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